补中益气汤对TGF-β1诱导的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤PI3K/AKT信号通路的影响①

王 莹 张 颖 高 原 王 淳 刘春英 （辽宁中医药大学中西医结合学院，沈阳 110847）

近年研究发现，脂酰肌醇3 激酶（phosphati‐dylinositol 3 kinase，PI3K）与其下游分子蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）组成的信号通路与多种肿瘤的发生密切相关［1-2］。PI3K/AKT 信号转导通路是细胞生存和增殖的主要通路，活化的PI3K/AKT信号通路通过激发下游多种蛋白磷酸化而促进肿瘤进展，贯穿肿瘤发展过程的始终［3］。目前以PI3K/AKT 信号通路为靶点的肿瘤治疗得到了密切关注，并在深入挖掘中。

有报道称，PI3K/AKT信号通路过度活化或激活可导致肿瘤细胞耐药；PI3K/AKT通路具有调节肿瘤细胞上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal tran‐sition，EMT）进程的作用，其活性增强可促进肿瘤增殖和转移［4］。由此可推测PI3K/AKT 信号通路可能是肿瘤细胞EMT与耐药的共同信号通路。

前期实验已经证实，A549/DDP 细胞荷瘤裸鼠EMT 与耐药存在明显相关性，补中益气汤具有干预肺腺癌荷瘤裸鼠EMT，改善顺铂耐药作用。本实验采用TGF-β1 过表达的A549/DDP 细胞制备荷瘤裸鼠，补中益气汤联合PI3K 通路抑制剂（LY294002）共同干预后，检测PI3K、AKT 和EMT 分子标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）、N-钙黏蛋白（N-cad‐herin，N-cad）在蛋白和基因水平上的表达，探求补中益气汤干预EMT 改善肺腺癌顺铂耐药是否与PI3K/AKT 信号通路有关，为补中益气汤临床治疗肺腺癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞株 SPF 级雄性BALB/c 裸鼠36 只，6 周龄，体质量（20±2）g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2014-0004，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（辽）2013-0009。肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP购于江苏齐氏生物科技有限公司。

1.1.2 药物 补中益气汤由黄芪18 g、白术9 g、人参6 g、升麻6 g、橘皮6 g、柴胡6 g、当归3 g、甘草9 g组成，以上饮片均购于辽宁中医药大学附属医院。依据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表”计算裸鼠等效剂量，按前期实验筛选的最佳用药剂量，即成人日推荐量的2 倍剂量（5.84 g/kg 生药）［5］，常规煎煮，水浴蒸发至1 g/ml 生药，4 ℃保存，备用。顺铂购自美国Sigma公司。

1.1.3 主要试剂 LY294002购于阿拉丁公司；Anti-E-cad、Anti-N-cad 购于美国Santa 公司；Anti-p-PI3K、Anti-p-AKT（Ser473）购于北京博奥森生物技术有限公司；Anti-PI3K、Anti-AKT 购于武汉三鹰技术有限公司；生物素标记的山羊抗兔IgG、生物素标记的山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记的链霉亲和素购于上海碧云天生物技术有限公司；DAB 显色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、ECL 检测试剂盒、HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）、内参抗体β-actin购于沈阳万类生物科技有限公司；PVDF 膜购于美国Millipore 公司；TRIpure、Super M-MLV 反转录酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix 购于北京百泰克生物技术有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 移植瘤模型的制备、分组及给药 36 只BALB/c 裸鼠适应性喂养1 周，按随机数字表法分为空载组（NG 组）、模型组（MG 组）、顺铂组（DDP 组）、补中益气汤+顺铂组（BCD 组）、顺铂+阻滞剂LY294002 组（DLY 组）、补中益气汤+顺铂+阻滞剂LY294002 组（BCDLY 组），共计6 组。TGF-β1 空载A549/DDP细胞、TGF-β1过表达A549/DDP细胞分别制备细胞悬液，各取100µl（约含1×107个细胞）分别接种于裸鼠左侧腋窝皮下。NG组接种TGF-β1空载A549/DDP 细胞，其余组接种TGF-β1 过表达A549/DDP 细胞。自接种当日起每天观察裸鼠状态及肿瘤生长情况。6 组裸鼠一般状况良好，均在接种后8 d 观察到注射部位皮下有直径2~3 mm 的肿瘤结节，说明接种成功，各组致瘤率均达100%。细胞接种8 d 后开始给药。NG 组和MG 组腹腔注射生理盐水0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃生理盐水，1 ml/次，2次/d；DDP 组腹腔注射顺铂0.003 5 g/kg，2 次/周，灌胃生理盐水，1 ml/次，2 次/d；BCD 组腹腔注射顺铂0.003 5 g/kg，2次/周，灌胃补中益气汤，1 ml/次，2次/d；DLY 组腹腔注射顺铂0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃生理盐水，1 ml/次，2次/d；BCDLY组腹腔注射顺铂0.003 5 g/kg，2 次/周，腹腔注射LY294002 0.025 g/kg，2 次/周，灌胃补中益气汤，1 ml/次，2 次/d。细胞接种32 d 后处死裸鼠，取肿瘤组织固定、冻存。

1.2.2 免疫组化法检测移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT 表达 切片脱蜡至水，微波加热修复抗原。滴加3%H2O2室温孵育15 min。滴加山羊血清室温孵育15 min。4 ℃孵育一抗工作液（E-cad、N-cad 1∶50；PI3K、AKT 1∶100；p-PI3K、p-AKT 1∶400）过夜。37 ℃孵育二抗工作液30 min（1∶200）。滴加HRP 标记的亲和素（1∶200），37 ℃孵育30 min。滴加100µl显色试剂，待颜色刚刚变深，迅速置于水中终止反应。苏木素复染，脱水、透明、封片。PI3K蛋白主要定位于细胞质，少数位于细胞膜，以细胞质和细胞膜出现深染的棕黄色颗粒为阳性结果；AKT 蛋白主要定位于细胞核和细胞质，以细胞核和细胞质上出现深染的棕黄色颗粒为阳性结果；E-cad蛋白主要定位于细胞膜和细胞质，以细胞膜和细胞质出现深染的棕黄色颗粒为阳性结果；N-cad 蛋白主要定位于细胞质，少数位于细胞膜，以细胞质和细胞膜上出现深染的棕黄色颗粒为阳性结果。

1.2.3 Western blot检测移植瘤PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表达 将肿瘤组织捣碎，使用RIPA∶PMSF（100∶1）裂解液裂解，离心提取总蛋白。采用BSA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。上样，SDSPAGE 电泳，转膜、封闭。4 ℃过夜孵育一抗（AKT 1∶500；PI3K、p-PI3K、p-AKT 1∶1 000）。37 ℃孵育二抗（1∶5 000），45 min 后发光、拍照，Quantity One 凝胶图像分析。

1.2.4 RT-qPCR 检测移植瘤E-cad、N-cad、PI3K、AKT mRNA 表达 采用TRIpure 裂解液提取细胞总RNA，检验样本RNA 纯度，计算RNA 浓度（g/L）。RNA 浓度=A260×40×稀释倍数/1 000。按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA。分析方法采用2−ΔΔCt法。RT-qPCR引物序列及扩增产物长度见表1。

表1 PCR引物序列及扩增产物Tab.1 PCR primer sequences and amplification products

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS17.0统计软件进行处理，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白的表达 各组间PI3K、AKT蛋白表达差异较小。p-PI3K、p-AKT蛋白表达组间差异性较大，与NG组相比，MG组p-PI3K、p-AKT 蛋白阳性表达明显增多；与MG、DDP组相比，BCD、DLY、BCDLY 组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达逐渐减少，BCDLY 组p-PI3K、p-AKT 蛋白阳性减少最为显著。免疫组化结果见图1。

图1 各组移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表达（IHC，×400）Fig.1 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（IHC，×400）

各组PI3K、AKT 蛋白表达略有差异，但均无统计学意义（P>0.05）。p-PI3K、p-AKT 蛋白表达组间差异较大，与NG 组相比，MG 组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达明显增多（P<0.05）；与MG、DDP 组相比，BCD、DLY、BCDLY 组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）；与DLY 组相比，BCDLY 组p-PI3K、p-AKT 蛋白表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot条带及统计结果见图2。

图2 各组移植瘤p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表达（±s，n=6）Fig.2 Expressions of xenograft p-PI3K，PI3K，p-AKT and AKT protein in each group（±s，n=6）

2.2 各组移植瘤PI3K、AKT mRNA 表达 与NG 组相比，MG 组PI3K mRNA 表达显著上调（P<0.05）；与MG、DDP 组相比，BCD、DLY、BCDLY 组PI3K mRNA 表达均有不同程度的下调（P<0.05）；与DLY组相比，BCDLY 组PI3K mRNA 表达下调（P<0.05）。各组间AKT mRNA 表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 各组移植瘤PI3K、AKT mRNA表达（±s，n=6）Fig.3 mRNA expressions of xenograft PI3K and AKT in each group（±s，n=6）

2.3 各组移植瘤E-cad、N-cad 蛋白表达 E-cad、N-cad 蛋白的阳性着色各组均有表达。与NG 组相比，MG 组上皮分子E-cad 蛋白表达明显减少，间质蛋白N-cad 蛋白表达明显增多；与MG、DDP 组相比，BCD、DLY、BCDLY 组上皮分子E-cad 蛋白表达逐渐增多，间质蛋白N-cad蛋白表达逐渐减少；与DLY 组相比，BCDLY 组上皮分子E-cad蛋白表达增多，间质蛋白N-cad蛋白表达减少。见图4。

图4 各组移植瘤E-cad、N-cad蛋白表达（IHC，×400）Fig.4 Expressions of xenograft E-cad and N-cad protein in each group（IHC，×400）

2.4 各组移植瘤E-cad、N-cad mRNA 表达 与NG组相比，MG 组上皮分子E-cad mRNA 表达显著下调，N-cad mRNA 表达显著上调（P<0.05）；与MG、DDP 组相比，BCD、DLY、BCDLY 组上皮分子E-cad mRNA 表达均有不同程度的上调，N-cad mRNA 表达均有不同程度下调（P<0.05）；与DLY组相比，BCDLY组上皮分子E-cad mRNA 表达增多，间质蛋白N-cad mRNA表达减少。见图5。

图5 各组移植瘤E-cad、N-cad mRNA表达（±s，n=6）Fig.5 Expressions of xenograft E-cad and N-cad mRNA in each group（±s，n=6）

3 讨论

PI3K/AKT是肿瘤中最重要的信号通路，直接关系到细胞的活化、增殖、癌变、凋亡等过程［6］。在已知的多种癌症中，过度活化的PI3K/AKT 通路因减少了细胞程序性死亡而促进细胞增殖。有研究发现，PI3K/AKT 信号通路与肿瘤细胞EMT 呈正相关，PI3K/AKT 信号通路的状态改变，肿瘤细胞的EMT会随之发生相应变化，其主要机制与PI3K/AKT 信号通路活化引起细胞间黏附能力下降有关［7］。

PI3K 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类，目前的研究热点主要是Ⅰ类，由调节亚基p85 和催化亚基p110 构成，与v-Sre、v-Ras 等癌基因的产物相关［8］。P13K 既有苏氨酸（Thr）/丝氨酸（Ser）激酶活性，也有磷脂酰肌醇激酶活性。PI3K激活后，其p110亚基催化在质膜上激活第二信使PIP3，触发PIP3 与信号蛋白AKT、PDK1 结合，引起AKT 蛋白磷酸化。AKT 是PI3K 最重要的下游效应蛋白，活化的AKT 通过介导下游多个靶蛋白的磷酸化调控细胞的生长、增殖，发挥抗凋亡作用［9］。AKT 活化涉及两个残基的磷酸化：激活回路上的苏氨酸308（Thr308）和C 端疏水基序中的丝氨酸473（Ser473）。在肿瘤细胞系中，使用PI3K 特异性抑制剂LY294002 可抑制AKT 功能，以p-AKT（Ser473）表达含量降低为主要指标［10］。隋华等［11］证实阻断PI3K/AKT 信号通路可改善人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-116/L-OHP 的药敏性，逆转P-gp介导的肠癌多药耐药。

本课题组前期研究证实，补中益气汤有调节PI3K/AKT 信号通路表达，改善肿瘤顺铂耐药的作用［12］。同时还发现，补中益气汤含药血清可通过干预A549/DDP 细胞EMT 改善其顺铂耐药［13］。鉴于PI3K/AKT 信号通路与肿瘤细胞生长、凋亡、耐药等过程密切相关，本研究以通路阻滞剂LY294002 为对照，通过分子生物学手段验证补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠PI3K/AKT 信号通路及EMT 分子标志物E-cad、N-cad表达的影响，以明确补中益气汤对该信号转导通路的作用。

免疫组化、Western blot 同时检测PI3K、AKT 蛋白和p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果显示，与空载组相比，模型组p-PI3K 和p-AKT 蛋白表达水平均升高；与模型组相比，补中益气汤组、顺铂+阻滞剂LY294002 组、补中益气汤+顺铂+阻滞剂LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白水平均有不同程度的降低，证实补中益气汤可通过下调PI3K 磷酸化水平抑制AKT 活化。补中益气汤+顺铂+阻滞剂LY294002 组效果最佳，与顺铂+阻滞剂LY294002 组比较差异有统计学意义，提示补中益气汤与LY294002 有协同效果，可共同作用于PI3K/AKT 通路，抑制其表达。各组PI3K、AKT 总蛋白表达几乎无变化，而p-PI3K、p-AKT 有变化，再次证实补中益气汤影响PI3K/AKT通路的活化过程。RT-qPCR 检测PI3K、AKT mRNA表达，结果显示，与空载组相比，模型组PI3K mRNA表达水平升高；与模型组相比，各治疗组PI3K mRNA 水平均有不同程度的降低，顺铂+阻滞剂LY294002 组、补中益气汤+顺铂+阻滞剂LY294002组差异有统计学意义。LY294002 竞争性地抑制ATP 与PI3K 激酶催化亚单位p110 的结合，是在蛋白水平上对PI3K磷酸化的抑制。由此推测，补中益气汤的作用靶点可能是在PI3K 基因水平上的某一位点，是通过减少PI3K mRNA 表达抑制PI3K 蛋白质的合成。各组间AKT mRNA 变化不显著，组间差异无统计学意义。推测补中益气汤和LY294002 只能抑制AKT 蛋白磷酸化，但并不影响其基因表达。这一结论与既往研究一致［14］。

EMT 是指上皮细胞在特定的生理、病理情况下向间充质细胞转化的现象［15］。研究表明，肿瘤细胞EMT 与肿瘤耐药密切相关，肿瘤细胞在发生EMT 的过程中，细胞极性丧失，可获得更高的转移与侵袭能力［16］。E-cad 和N-cad 是EMT 的主要分子标志物［17］。TGF-β 是一种多肽性细胞生长负调控因子，为肿瘤细胞EMT 的主要诱导因子，与多种上皮性肿瘤的生长、转移有关，其中以TGF-β1 最常见，活性也最强［18-19］。

TGF-β1 诱导EMT 的过程与多条信号转导通路相关，如：Notch、Hippo、Smad、PI3K/AKT 等［20-23］。其中，PI3K/AKT 被认为是肿瘤细胞EMT 最重要的信号通路之一［24-25］。PI3K/AKT 通路的激活与TGF-β1诱导的肿瘤细胞EMT 呈正相关［26-27］。研究表明，PI3K/AKT 信号通路被TGF-β1 激活后，促使TGF-β1诱导的肺癌细胞发生EMT，使用PI3K/AKT 信号通路抑制剂阻止其激活，肺癌细胞发生EMT 的过程随之显著降低［28-29］。李优等［30］研究发现，姜黄素能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 通路激活进而抑制TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT。

本研究发现，与TGF-β1空载组相比，TGF-β1过表达的肺腺癌荷瘤裸鼠移植瘤模型组PI3K、AKT 总蛋白表达变化较小，而活化的p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显增多，提示PI3K/AKT 通路被TGF-β1 激活。进一步研究发现，与模型组相比，应用补中益气汤的药物组PI3K、AKT总蛋白表达变化较小，而p-PI3K、p-AKT蛋白表达明显减少，与PI3K/AKT通路的抑制剂LY294002 的作用相似，提示补中益气汤可抑制TGF-β1 对PI3K/AKT 通路的激活。上述研究中，各组EMT 分子标志物E-cad 和N-cad 蛋白及mRNA 表达与PI3K/AKT 信号通路激活变化呈正相关，进一步表明补中益气汤可通过抑制TGF-β1 激活PI3K/AKT 通路，进而抑制肺癌细胞发生EMT。综上所述，补中益气汤改善肺腺癌顺铂耐药的机制可能与其抑制TGF-β1对肺腺癌细胞PI3K/AKT信号通路的激活，进而抑制EMT有关。

肺癌术后及放化疗患者具有“正虚邪衰”的特点，重在提高机体免疫力。随着现代治疗技术的不断发展和创新，免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗新焦点［31］。抗肿瘤免疫治疗与中医“扶正培本”抗癌理念相契合，补中益气汤恰是“扶正培本”的代表方剂，具有扶助正气，促进气血生化，兼以祛邪的作用。现代医学研究证实，补中益气汤中的有效化学成分包括多糖、生物碱、皂苷、挥发油等，无论复方还是方中的单味药提取物均可表现出多个药理作用靶点，调节免疫功能可能是其中之一。临床应用补中益气汤可提高机体免疫功能，减轻化疗的消化道反应，促进术后机体恢复，改善营养状况等［32-33］。肺癌在发生发展过程中与机体的免疫功能有十分密切的相互作用。当外周血中的免疫细胞处于平衡状态时，肺癌患者的预后最佳［34］。陈记财等［35］研究发现，应用补中益气汤可改善非小细胞肺癌患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK 细胞水平，降低白细胞减少的发生率。课题组前期研究发现，补中益气汤可下调A549 荷瘤裸鼠脾脏中Fas 蛋白表达，促进机体免疫系统对肺癌细胞的杀伤［36］。补中益气汤是否能进一步调节肺腺癌A549/DDP 荷瘤裸鼠的免疫功能或改善其肿瘤微环境，其具体作用机制如何，值得进一步探讨，以期为补中益气汤临床抗肿瘤应用提供确切的理论依据。