抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响

王立斌 王军乾 赵 凌 黄振华 王 萌 王靖雷 余四九，2 潘阳阳，*

（1甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070）

抑制素A（inhibin A，INHA）是由卵泡颗粒细胞分泌的一种调节卵泡生长发育、卵子生成和配子形成的内分泌激素。雌性动物和雄性动物不同器官产生不同的抑制素（inhibin，INH）。雌性动物既能产生INHA 也能产生抑制素B（inhibin B，INHB），而雄性动物只能产生INHB［1-2］，说明INHA 在雌性生殖系统中发挥独特的作用。INHA 和INHB 失活对雄性生殖系统没有明显影响，但会导致雌性动物胚胎发育的吸收能力减弱及卵巢功能受损，而INHA 能增强雌性小鼠促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）对卵泡发育的依赖性，并提高自然排卵率［3］。INH 的结合位点和受体位于垂体、卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞［4-5］。INH 可以通过内分泌和局部作用的方式调节卵泡发育［6-8］。临床研究发现，INH 免疫动物能使垂体分泌的FSH 和促黄体素（luteinizing hormone，LH）减少［9］，用抑制剂处理绵羊卵丘细胞可以抑制细胞内促卵泡素受体（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）、促黄体素受体（luteinizing hormone receptor，LHR）的表达［10］，由此推测INHA 对牦牛（Bos grunniens）卵泡颗粒细胞中FSH和LH及其受体同样会产生影响。

FSH 和LH 主要调节卵泡的生长发育、成熟和排卵。在哺乳动物中，FSH和LH对卵母细胞恢复减数分裂的作用机理是：二者通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）产生细胞生物学反应［11-13］。MAPK 激活了颗粒细胞膜上的细胞生物学反应，影响卵丘细胞和卵母细胞之间的信号转导［14］，既提高颗粒细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，也降低卵母细胞中的cAMP 和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平，使卵母细胞恢复减数分裂，最终促进卵泡完成排卵［15-16］。在雌性生殖系统中，FSH 调节小卵泡的生长发育，促进卵泡成熟，并刺激卵泡内颗粒细胞合成INHA［17-18］。LH是由垂体分泌的调节卵泡发育的激素，通过与颗粒细胞膜上的受体结合，诱导成熟卵泡排卵，促进卵泡向黄体转化［19］。说明颗粒细胞中FSHR和LHR影响FSH和LH对卵泡的调节作用。

INH 可以通过cAMP 和三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的产生启动主要信号级联，从而调节FSH 和LH 的分泌，这些由FSH 和LH 调节的颗粒细胞信号级联在卵泡发育、排卵中起重要作用［20］。INHA作为雌性动物特有的一种激素，目前关于INHA 对动物卵泡发育和生殖功能影响的研究较少。为探究INHA对卵泡颗粒细胞的调控作用，本研究用不同浓度的INHA 处理牦牛卵泡颗粒细胞并检测激素和受体的表达变化情况，以进一步发掘INHA 对牦牛卵泡颗粒细胞的调节作用机制，以期为探索抑制素对雌性牦牛生殖调控的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品处理 试验样品取自青海省西宁市清源屠宰场，3～6 岁雌性牦牛，体况良好，无明显临床疾病。牦牛禁食8～10 h 后，颈动脉放血屠宰，30 min 内采集10 对牦牛卵巢，用含有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3次，3 h内带回实验室做原代颗粒细胞培养。

1.1.2 仪器设备 T100TMThermal Cycler PCR 仪，德国Eppendorf公司；BIO-RAD酶标仪，美国Biorad公司；实时荧光定量PCR 仪，上海Roche 生物科技公司；DP71 显微照相系统、Olympus DSU 活细胞工作站，日本Olympus公司。

1.1.3 试验试剂 Inhibin A，美国R&D Systems；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、细胞基础培养基（basic cell culture medium）和磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered salina，PBS），上海Gibco 公司；细胞计数试剂（cell counting kit-8，cck-8），武汉菲恩生物科技有限公司；FSHR 抗体（AF-5242），江苏亲科生物研究中心有限公司；LHR 抗体（bs-6431R）、荧光二抗、山羊抗兔抗体（Goat Anti-Rabbit IgG）和免疫组化染色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；牛促卵泡素（FSH）、黄体生成素（LH）和雌二醇（estradiol，E2）酶联免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，上海机纯实业有限公司；胰蛋白酶，美国Sigma 公司；曲拉通X-100（Triton X-100），武汉卡诺斯科技有限公司；细胞核染料（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），北京索莱宝生物公司；TransZol RNA 提取试剂盒，北京全式金公司；GoscriptTMReverse Transcription System 反转录试剂盒，美国Promega 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），上海碧云天生物公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 利用Primer Premier 6.0 设计7 对引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.2 牦牛卵泡颗粒细胞体外培养 将牦牛卵巢置于37 ℃含有青霉素和链霉素的生理盐水中清洗3 次，在3 h 内用注射器抽取直径为3～8 mm 卵泡中的卵泡液后注入15 mL 离心管，将混匀后的卵泡液用100 nm孔径的细胞滤器过滤，然后以1 500 r·min-1的转速离心10 min，形成的沉淀即为所需的原代牦牛颗粒细胞。再用配制的10%细胞培养液（10%全培）［90 mL 细胞基础培养基（DMEM/F12）+10 mL 胎牛血清+1 mL双抗］清洗3 次后通过细胞板计数法调整密度接近5×105个·mL-1，并接种于25 cm2的细胞培养瓶中，在37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h 内每隔8 h 按照半换液法（弃一半培养瓶中一半的细胞培养液，再加入等量配制的细胞培养液）换液，待细胞生长稳定后每36 h更换一次10%全培。

1.2.3 CCK-8 法测细胞生长曲线 待第一代颗粒细胞在培养瓶中长满以后，用0.25%的胰蛋白酶进行消化，显微镜观察待细胞全部消化后加入10%全培中终止消化，再以1 500 r·min-1离心10 min，加入适量10%全培制成细胞悬液，再用活细胞计数法将细胞悬液浓度依次稀释为0.5×104、1.5×104、2.5×104、3.5×104、4.5×104个·mL-1，将不同浓度的细胞悬液各加100 µL于96 孔板中，每个浓度重复加4 孔，并在37 ℃、5%CO2条件下培养4 h 使细胞完全贴壁，然后弃去细胞培养液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，之后每孔加入90 µL DMEM/F12 培养基和10 µL CCK-8 试剂，再置于细胞培养箱3 h 后以490 nm 波长测光密度（optical density，OD）值，以细胞悬液浓度为横坐标，OD 值为纵坐标建立颗粒细胞标准曲线方程。

将上述颗粒细胞以0.5×104个·mL-1细胞密度接种于96 孔板中，每孔加100µL 混有颗粒细胞的培养液，置于细胞培养箱中培养，待细胞完全贴壁后选择其中4 孔弃去培养液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，加入90 µL DMEM/F12 培养基和10 µL CCK-8 试剂，培养3 h 后在490 nm 波长下测OD 值，其余孔弃去培养液，用PBS清洗3次，每次3 min，然后加入10%的全培，24 h后再选择4 孔按照上述方法以490 nm 波长测OD 值，连续测8 d 后，以培养天数为横坐标，细胞数量为纵坐标绘制颗粒细胞生长曲线。

1.2.4 FSHR、LHR 在颗粒细胞的定位检测 通过免疫荧光化学方法检测牦牛卵泡颗粒粒细胞上FSHR、LHR 的表达。先用0.25%胰酶消化第一代颗粒细胞，待细胞全部消化后1 500 r·min-1离心10 min，用10%全培制成细胞悬液，用活细胞计数法将细胞密度调至5×105个·mL-1，然后接种到2 个放有盖玻片的细胞培养皿中，在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁后取出爬片，用PBS清洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛固定，再用PBS 清洗3 次，每次3 min，并加入0.1%TritonX-100 室温条件下透化40 min，再用PBS 清洗3 次，每次5 min，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室温封闭1 h，弃去封闭液并用PBS 清洗3 次×5 min，加入稀释的FSHR、LHR 抗体（1∶100），4 ℃孵育12 h，再用PBS 清洗5 次，每次3 min，用荧光二抗（1∶200）孵育1 h，用PBS 清洗5 次，每次3 min 后，用DAPI 染色液染核5 min，再用PBS 清洗5 次，每次3 min后用抗荧光猝灭剂封片，在活细胞工作站观察并拍照。

1.2.5 不同浓度INHA 处理颗粒细胞 将第一代对数生长期的牦牛卵泡颗粒细胞进行胰酶消化，全部消化后加入适量的10%全培以1 500 r·min转速离心10 min，再用10%全培把细胞密度调至2.0×104个·mL-1，接种在6 孔板中，显微镜下观察至细胞贴壁生长到60%左右时，弃去细胞培养液，用PBS 清洗3 次，每次3 min，再加入无血清细胞培养液培养12 h 进行饥饿处理，然后添加不同浓度INHA 的细胞培养液对其进行处理：INHA 浓度分别为0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1，培养12 h后各收集1 mL 6个不同浓度INHA的细胞培养液，并弃去剩余的细胞培养液，用PBS清洗3次，每次3 min，用0.25%胰酶消化细胞，完全消化后1 500 r·min-1离心10 min，将6 组处理的细胞加入1 mL PBS 中震荡并在-80 ℃下反复冻融6 次（每次60 min，室温条件下溶解后涡旋），完成6 次冻融后即可提取细胞内容物。以同样的方法用不同浓度的INHA 处理颗粒细胞后，分别提取细胞总RNA。

1.2.6 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达 用TransZol 试剂盒提取6 组INHA处理的颗粒细胞RNA，再参照反转录试剂盒合成cDNA，置于-20 ℃条件下保存。qRT-PCR 反应体系共20µL：SYBR Premix Ex TaqⅡ10µL、cDNA 2µL、上下游引物各0.5 µL、H2O 7 µL。反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环；72 ℃终延伸5 min。每个样品重复检测3次，利用2-ΔΔct法分析基因的相对表达量。

1.2.7 酶联免疫分析法（ELISA）检测FSH、LH 含量 将提取的颗粒细胞上清液和内容物在4 ℃、1 500 r·min-1条件下离心15 min，取上清液作为样品待测。然后依次参照牛促卵泡素、牛促黄体素酶联免疫分析试剂盒的操作步骤进行：加标准品、加样品、加酶、温育、配液、洗涤、显色、终止，以450 nm 波长测定OD 值。再以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标建立标准曲线方程，将样品OD 值代入标准曲线方程得出相应浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。

1.2.8 数据分析 单因素方差分析4 种基因的相对表达水平，利用SPSS 19.0处理数据，用Graphpad prism 7.0制图。

2 结果与分析

2.1 牦牛卵泡颗粒细胞体外培养结果

牦牛原代颗粒细胞生长速度较慢，形态呈多边形；第二代颗粒细胞形态结构清晰可辨，生长速度较快，细胞贴壁较好，形态近似为梭形，细胞间出现接触抑制，细胞生长融合度达到80%以上（图1）。

图1 牦牛颗粒细胞体外培养的生长情况Fig.1 Growth of yak granulosa cells in vitro culture

2.2 牦牛颗粒细胞的生长曲线

以第二代牦牛颗粒细胞培养天数为横坐标，细胞数量为纵坐标，绘制颗粒细胞生长曲线，结果生长曲线呈“平稳-上升-平稳”的走势（图2）。细胞培养第1～第2 天为缓慢生长的潜伏期，第3～第4 天为快速生长的对数期，第5～第8 天细胞生长缓慢，此阶段为平台期。

图2 牦牛颗粒细胞生长曲线Fig.2 Growth curve of yak granulosa cells

2.3 FSHR和LHR在牦牛颗粒细胞中的分布

用FSHR、LHR 蛋白对牦牛颗粒细胞进行免疫标记（图3），免疫荧光检测显示，DAPI主要在牦牛颗粒细胞的细胞核上显色，FSHR 和LHR 的目的蛋白在细胞核和细胞质均有表达，叠加后发现LHR 在细胞质的表达比FSHR强。

图3 FSHR、LHR在牦牛颗粒细胞的定位Fig.3 Localization of FSHR，LHR in yak granulosa cells

2.4 不同浓度INHA处理后对颗粒细胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR表达的调节

用浓度为0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 处理第二代牦牛颗粒细胞12 h，结果如图4所示。适当浓度的INHA 能明显改变牦牛颗粒细胞FSHβ、LHβ、FSHR、LHR的表达水平。当INHA 浓度小于5 ng·mL-1时，颗粒细胞中FSHβ的表达量随着INHA 浓度的增大而降低；当INHA 浓度大于5 ng·mL-1时，FSHβ的表达量显著高于D 处理组。当INHA 浓度小于10 ng·mL-1时，颗粒细胞中LHβ的表达量随着INHA 浓度的增大而降低；当INHA 浓度大于10 ng·mL-1时，LHβ的表达量显著高于E处理组。A～F六个处理组结果均显示，随着INHA 浓度的增大，颗粒细胞中FSHR和LHR的表达量逐渐降低（图4）。

图4 不同浓度INHA作用牦牛颗粒细胞后FSHβ、FSHR、LHβ、LHR基因的相对表达水平Fig.4 Relative expression levels of FSHβ，FSHR，LHβ，LHR by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

2.5 不同浓度INHA 处理后对颗粒细胞分泌FSH、LH的调节

用浓度为0（A）、1.25（B）、2.5（C）、5（D）、10（E）、20 ng·mL-1（F）的INHA 处理第二代牦牛颗粒细胞12 h，结果如图5所示。当INHA 浓度为5 ng·mL-1时，细胞内外FSH 含量均最低；INHA 浓度为10 ng·mL-1时，细胞内外LH 含量均最低。在细胞内容物中，D 处理组的FSH 含量显著低于E 处理组，而E 处理组的FSH 含量显著低于A、B、C、F 处理组；E 处理组的细胞内LH 含量显著低于D 处理组，而D 处理组的LH 含量显著低于A、B、C、F 处理组。在细胞上清液中，D处理组的FSH 含量显著低于A、B、C、E、F 处理组，而B、C、E、F 处理组的FSH 含量显著低于A 处理组；细胞外E 处理组的LH 含量显著低于A、B、C、D、F 处理组，而B、C、D、F 处理组的LH 含量显著低于A 处理组。

图5 不同浓度INHA作用牦牛颗粒细胞后分泌FSH、LH的激素水平Fig.5 Hormone levels of FSH and LH secreted by yak granulosa cells treated with different concentrations of INHA

3 讨论

颗粒细胞是卵巢中的主要细胞类型，为卵母细胞的生长提供微环境和物理支持［21］。研究发现，在不同的细胞模型中，INHA 被认为与细胞增殖和凋亡有关，即能促进颗粒细胞增殖并抑制颗粒细胞凋亡［22］；颗粒细胞可以维持卵巢的正常功能，当颗粒细胞发生凋亡时会导致卵泡闭锁［23］。本试验结果显示，适当浓度的INHA 可以降低牦牛卵泡颗粒细胞中FSH、LH 及其受体的表达，说明INHA 作为雌性动物特有的一种激素，对调控牦牛生殖机理具有重要影响。用浓度为0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1的INHA 处理牦牛卵泡颗粒细胞12 h，发现FSH、LH 在颗粒细胞内容物和细胞上清液中的含量存在显著差异，且二者通过与颗粒细胞膜上的受体结合调节卵泡的生长发育和排卵［24］，证明INHA对雌性牦牛的生殖调控具有重要影响。

哺乳动物卵泡的发育和排卵主要受促性腺激素的调控，尤其是FSH 和LH 在卵泡不同发育阶段发挥重要作用［25］。FSH主要促进有腔卵泡的生长发育，LH能够触发成熟卵泡排卵，且二者协同促进卵泡中雌激素的分泌［19］。INH 对卵泡颗粒细胞中的FSH 和LH 具有负反馈调节作用，INH 可以抑制垂体分泌FSH 和LH，而FSH 可以刺激卵泡颗粒细胞分泌INHA［17］，由此推断INHA 对牦牛卵泡颗粒细胞有重要影响。本试验结果显示，牦牛卵泡颗粒细胞中FSHβ和LHβ基因的表达与INHA 呈剂量依赖性关系，其表达量随INHA 浓度的增大呈先下降后上升的趋势，且FSHβ和LHβ表达量最低时，INHA 浓度分别接近5 ng·mL-1和10 ng·mL-1，证明INHA 能够影响FSHβ和LHβ在颗粒细胞中的表达，而是颗粒细胞中两种基因的表达量受INHA 浓度变化的影响。

本研究以牦牛卵泡颗粒细胞为模型进行体外细胞培养试验，经牦牛卵泡颗粒细胞原代培养后进行传代，获得了细胞生长稳定、形态结构清晰的第二代牦牛卵泡颗粒细胞。IF 检测结果显示，FSHR 和LHR 在牦牛颗粒细胞的细胞核和细胞质均有表达，而LHR 在细胞质的表达比FSHR 强，说明LHR 的作用部位以细胞质为主，FSHR 在细胞质和细胞核均发挥作用。由于受体在细胞内需要与相应的配体结合发挥其作用［26-27］，由此推断FSH 和LH 对卵巢发挥的作用主要由受体决定。

本试验用0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL-1INHA 处理第二代牦牛卵泡颗粒细胞12 h后发现，FSHR和LHR基因在牦牛卵泡颗粒细胞中的表达水平随着INHA 浓度的增大而降低。INHA 明显抑制FSHR、LHR在颗粒细胞中的表达，且抑制作用随INHA 浓度增大而增强。FSHR 和LHR 能够与相应的配体结合发挥作用，INHA的抑制作用明显降低了FSH、LH 与受体的结合率，最终导致FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达量升高，由此推断INHA可以降低FSH、LH与其受体的结合率。

INHA由卵泡颗粒细胞产生，该物质可以对颗粒细胞内的激素发挥协调作用［28-29］，其中FSH 和LH 直接影响动物的发情、排卵、妊娠等过程［30］。本研究通过ELISA检测发现，A～F六个处理组中，D处理组的颗粒细胞内外FSH 含量显著低于其他5 个处理组，而E 处理组的颗粒细胞内外LH 含量显著低于其他5 个处理组，说明适当浓度的INHA 可以减少颗粒细胞中FSH和LH 的含量，以此证明INHA 可以抑制颗粒细胞分泌FSH 和LH［9］。将细胞内容物中FSH 和LH 的含量与细胞上清液中FSH 和LH 的含量相比发现，除对照组A外，当细胞内容物中FSH 和LH 含量下降时，细胞上清液中FSH 和LH 含量呈上升趋势，由此说明INHA 对调控颗粒细胞内外FSH 和LH 的含量有浓度适应性，从而维护卵巢功能的稳定。本试验还需要验证相关受体在牦牛卵巢和卵泡中的表达变化规律。

4 结论

INHA 对FSHR 和LHR 在牦牛卵泡颗粒细胞中的表达存在明显的抑制作用，并且影响FSH 和LH 在卵泡中发挥的作用。研究表明INHA 能抑制牦牛卵泡颗粒细胞中FSH、LH与其受体的结合，同时INHA对颗粒细胞内外FSH和LH的含量有重要调节作用。