EMS诱导粒用高粱的突变体筛选和鉴定

于 淼 陈冰嬬 石贵山 冯咏琪 杨永志 李海青 唐玉劼 王 鼐，*

（1吉林省农业科学院作物资源研究所，吉林 长春 130033；2吉林省种子管理总站，吉林 长春 130031；3吉林省红粮种业科技有限公司，吉林 公主岭 136100）

高粱［Sorghnm bicolor（L.）Moench］是我国重要的粮饲作物和酿造原料［1］，具有耐旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱等特性，而且光合效率高、杂种优势强、产量稳定，在农业生产中占有重要地位［2-3］。高粱新品种的选育是满足其生产发展的有利前提，但自1990年以来，高粱品种资源遗传基础日趋狭窄，育成品种间遗传差异小，品质和抗性一直未有提高，突破性品种资源匮乏，因此，创制优良高粱新种质是拓宽种质资源和培育新品种的关键［4-5］。由于化学诱变技术具有成本低，使用方便，点突变率高，染色体畸变异少、易于筛选等优点，现已成为作物优异种质资源创制和基因功能研究的有效方法，被育种者广泛使用［6］。其中，甲基磺酸乙酯（ethyl methyl sulfone，EMS）能打破性状间的紧密连锁，促进基因重组，可有效改良作物的个别单一性状，被认为是最高效、安全的化学诱变剂，已广泛应用于花生［7］、拟南芥［8］、大豆［9］、玉米［10］、水稻［11］、大麦［12］、小麦［13］、油菜［14］等作物的诱变育种。2008年Xin 等［15-16］利用EMS处理高粱BTx623种子，构建了1 个包含矮化、叶色和叶形等不同类型突变体的高粱突变体库，并从M4突变体库中获得可稳定遗传的矮化突变体dw5，构建了突变体dw5 与BT×623 杂交的F2代群体。2019年Chen 等［17］利用此群体获得了1 个矮化新基因，并命名为Dw5。2010年吕鑫等［18］最先在国内开展高粱EMS 诱变的相关研究，获得了一批有关株高、穗长和育性及结实率等性状的突变体。之后越来越多的研究学者对山西、山东、四川等地主推的高粱品种和骨干亲本进行EMS 诱变处理，为遗传改良提供了丰富的表型变异材料［19-20］。但是，仍鲜有以北方粒用高粱为材料的化学诱变相关研究，因此，本研究以吉林省应用的粒用高梁骨干亲本恢复系10125 和保持系2055B 为研究材料，以不同浓度EMS 和浸种时间处理高粱种子，统计处理后高粱的出苗及农艺性状的诱变效应，确定2 种类型高粱种子最佳的EMS 诱变条件，并在M2代对诱变材料进行表型的鉴定筛选，以期为高粱突变体库构建、高粱新品种选育提供基础材料和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

供试材料为2 个粒用高粱亲本系，由吉林省农业科学院作物资源研究所选育。保持系2055B：生育期112 d，分蘖弱，株高70 cm，穗紧圆筒型，穗长21 cm，无芒，单穗粒重65 g，籽粒浅黄白色圆形，千粒重28.8 g。恢复系10125：生育期120 d，分蘖弱，株高125.6 cm，穗紧棒型，穗长27.0 cm 左右，无芒，单穗粒重72.3 g，籽粒红色卵形，千粒重30.2 g。

处理所用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变剂购自美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理 试验设置8 个浓度（0%、0.1%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.5%）的EMS 诱变剂溶液，挑选籽粒饱满的种子分别进行诱变处理。每个处理300粒种子，3次重复。置于培养皿中用蒸馏水浸泡4 h，将浸泡后的种子分别用配置好的8 个浓度的EMS 诱变剂分别进行8、14、20、26 h 的浸种处理。处理结束后用流水冲洗种子4 h，置于通风干燥处晾干，2019年5月20日将处理的种子点播于吉林省农业科学院公主岭试验基地，种子播种距离5 cm，行距60 cm，共80 个小区（3 m×3 m）。所有田间管理均采用高粱大田常规管理。

1.2.2 M1代处理 2019年播种后，调查出苗时间、出苗数、成苗数。出苗时间以调查之后连续3 d无新苗出现为准，成苗数以长至三叶一心的健康幼苗为准。在M1代开花期对所有单株进行套袋自交，成熟期调查结实率。

1.2.3 M2代处理 将M1代自交种子按照相同EMS浓度，不同诱变时间，进行单株收获。将收获的M1代自交种子于2020年5月12日种植于吉林省农业科学院公主岭试验基地，M2代按株系种植，每株系1 行，行长3.0 m，行距0.60 m，株距0.13 m。调查记载M2代每株的表型，统计各处理的突变率。

1.3 数据分析

数据整理、处理及作图采用Microsoft Excel 2019软件，方差分析采用SPSS 22.0软件。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对高粱种子出苗率的影响

如图1所示，EMS 处理对两亲本出苗都具有一定抑制作用，出苗率均表现出随着EMS 浓度增加和诱变时间延长而逐渐降低，但在诱变时间8 h、EMS 浓度小于0.2%时，2055B 和10125 的出苗率均明显高于CK。可见，低浓度短时间的诱变处理对高粱种子出苗有一定的促进作用，高浓度长时间诱变抑制高粱种子出苗。2055B 经EMS 处理的诱变时间和浓度在14 h/20 h+0.3%以上时，所有处理组合出苗率均不足50%；10125经EMS 处理的诱变时间和浓度在14 h+0.3%/20 h+0.25%以上时，所有处理组合出苗率均不足50%。诱变时间为26 h时，EMS浓度为0.5%，10125种子出苗率为0，EMS 浓度大于0.3%，2055B 种子出苗率为0，表明EMS 达到一定的时间和浓度后，种子致死，不能出苗。总体来看，同一水平处理恢复系10125出苗率高于保持系2055B，说明EMS处理对2055B的出苗率影响更大。

图1 EMS处理对高粱M1代的出苗率的影响Fig.1 Effects of the EMS treatment on seeding emergence rate on M1 germination

2.2 EMS处理对高粱M1代幼苗成活率的影响

以调查期内最后成苗数占总出苗数的百分比来计算幼苗成活率，结果如图2所示。对照出苗时间为3～5 d，成苗率高达97.0%；随着EMS 浓度的增加和诱变时间的延长，出苗时间也延后，26 h+0.25%处理的出苗时间为14～17 d，2055B 和10125 的成苗率分别为49.98%、67.23%，说明EMS 处理延长了M1的出苗时间，且有致死现象。EMS处理对2055B和10125成苗率的影响总趋势一致，即随着EMS 浓度增加和诱变时间延长，抑制作用增强，但是在EMS 浓度为0.10%～0.25%、诱变时间为8～20 h条件下，两亲本成苗率与对照相比差异明显。当EMS浓度为0.5%时，不同诱变时间下两亲本成苗率均下降到不足70%，诱变时间为26 h时，成苗率为0%。

图2 EMS处理对高粱M1代的成苗率的影响Fig.2 Effects of the EMS treatment on seedling rate on M1 germination

2.3 EMS处理对高粱种子结实率的影响

在成熟期调查M1代植株的结实情况，数据统计结果如图3所示。随着EMS浓度的增加和诱变时间的延长，结实率逐渐降低。当EMS 浓度为0.1%，诱变时间为8、14、20 h 时结实率均达到50%以上。当EMS 浓度为0.2%时，诱变8 h 的2055B 和10125 结实率分别为70%、85%，而诱变26 h的2055B和10125的结实率仅有15.3%和25.0%，差异明显。当EMS浓度为0.25%时，除了诱变8 h，其他3 个诱变时间的2055B 和10125 结实率均不足50%。当EMS浓度为0.3%时，2055B的四个诱变时间的结实率均不足30%，10125 在诱变8 h 的结实率为70%，其他3 个诱变时间的两亲本结实率均不足30%。当EMS 浓度达到0.4%以上时，诱变8 h 后的2055B 和10125 的结实率分别为10%、12%，其他诱变时间的两亲本结实率均为0。

图3 EMS 处理对M1代种子结实率的影响Fig.3 Effects of the EMS treatment on seed seting rate on M1 germination

2.4 EMS处理后M2代高粱植株突变率

调查M2代植株的表型变化来统计各处理的突变率，结果如图4所示。EMS 处理浓度和诱变时间在26 h+0.3%以上时，2055B 的出苗率为0；EMS 处理浓度和诱变时间在26 h+0.35%以上时，10125 的出苗率为0，此时两亲本系均没有突变株。EMS 处理时间和浓度为20 h+0.5%时，2055B 和10125 的突变率最高，分别为21.3%和46.8%；但此诱变处理严重抑制了种子的出苗率和结实率，且较少的种子数量不利于突变体库的构建。同一浓度和时间处理水平下，2055B 的变异率明显高于10125，表明EMS处理后2055B更敏感。

图4 EMS处理对M2代植株突变率的影响Fig.4 Effects of the EMS treatment on plant mutation rate on M2 germination

2.5 EMS处理后M2代高粱植株表型变异

2.5.1 叶部性状变异 在10125 和2055B 的诱变群体M2代中，均观察到叶片有白化和黄化出现，其中部分幼苗整株都发生白化或黄化（图5-a、c），植株因不能正常光合作用而死亡。部分幼苗叶片有黄色条纹（图5-b），能正常成熟结粒。在M2代中，观察到一些较对照叶片多、叶片宽大的突变体单株，该类突变材料光合作用强，穗型偏散，单株产量高，但不符合现今育种目标对亲本材料株型耐强、穗型紧凑的要求。在M2代中，还筛选出适于育种的基础材料，表现为较对照叶片窄小，植株直立上冲，耐密植。高粱叶脉颜色常见的有黄色、绿色和白色。本研究中2055B的叶脉为白色，在2055B 的EMS 处理浓度和诱变时间为14 h+0.25%时M2代发现一株黄色叶脉突变体（图5-d、e）。

图5 2055B EMS诱变后代的叶片突变类型Fig.5 Leaf mutation types of EMS mutagenized offspring for 2055B

2.5.2 株型和穗部性状变异 恢复系10125 株高一般在120～125 cm，EMS 诱变时间和浓度在14 h+0.35%处理后的群体中，出现了株高55～70 cm 的矮化突变体（图6-a）。在10125 的14 h+0.3%EMS 处理中，有1 株3 个分蘖和1 株5 个分蘖的突变体（图6-c、d）。恢复系1012为穗紧呈棒型，2055B的穗紧为筒型，在诱变后的M2代群体中，筛选出穗型为穗紧纺锤型穗（图6-f）、穗紧筒型穗（图6-g）和散穗伞型穗（图6-h）的突变体。恢复系10125粒色为红色，EMS诱变时间和浓度在14 h+0.3%时有1株白粒突变；2055B的粒色为粉白色，诱变处理后有红粒突变。

图6 10125 EMS诱变后代的株型和穗部突变类型Fig.6 Plant type and panicle mutation types of EMS mutagenized offspring for 10125

2.5.3 生育期和结实率变异 对诱变处理的高粱M2代成熟期进行调查，结果见图7。EMS 处理后，部分突变体比对照提前7 d 左右成熟，部分突变体延后8 d 左右成熟，还有些突变体甚至延后15 d成熟，表现为诱变处理后晚熟材料多于早熟材料。EMS 处理后，高粱M2代种子结实率降低，结实率为30%～70%。

图7 10125 EMS诱变后代的生育期和结实率突变类型Fig.7 Fertility period and seed set rate types of EMS mutagenized offspring for 10125

3 讨论

EMS 诱变处理是构建饱和突变体库的有效途径，诱变后种子的突变率、出苗率和结实率是筛选诱变适宜浓度和时间的重要指标。高浓度长时间的诱变会严重降低种子的出苗率和结实率，遗漏可利用的突变体；低浓度短时间的诱变会降低突变率，提高出苗率和结实率，加大突变体的筛选工作量［21-23］。在同一诱变条件下，恢复系10125 的出苗率、成苗率、结实率受抑制作用小于保持系2055B，突变率低于2055B，可能与恢复系比保持系种子有更强的出苗动力有关［24］。选用这两粒用高粱亲本系构建高粱突变体库时，恢复系10125 所需的EMS 处理浓度和诱变时间高于保持系2055B。综合考虑出苗率、结实率和突变率，2055B EMS 诱变时间和浓度为14 h+ 0.25%时，田间出苗率为55.53%，成苗率为89.25%，结实率为20.00%，突变率为12.70%，是较为适宜的处理条件；恢复系10125 EMS 诱变时间和浓度为14 h+0.3%时，田间出苗率为53.53%，成苗率为97.11%，结实率为15.30%，突变率为12%，是较为适宜的诱变条件。王春语等［25］和刘言龙等［26］对高粱品种BTx623 的突变种子鉴定筛选时发现，采用多浓度多时间的处理方式可使突变类型更多样，从而构建饱和的近等基因系突变体库。因此，本试验中两粒用高粱亲本系可根据试验需求进行组合处理，诱变时间均为14～20 h，保持系2055B 的诱变浓度为0.20%～0.25%，恢复系10125 的诱变浓度0.25%～0.35%。

多样的种质资源是现代育种的物质基础，用EMS诱导突变体在较短的时间内可以获得更多的优良变异类型［27］。前人研究表明，M2代是选择突变体的关键时期，因为EMS 诱导的突变属于隐形突变，诱变当代表型不明显，在M2代开始产生分离［28-29］。本研究通过对EMS 处理的诱变后代M2代进行表型观察、鉴定和筛选，低浓度短时间的诱变，即诱变时间8～14 h，诱变浓度0.1%～0.2%，M2代突变频率低，突变类型很少，早熟材料居多；高浓度长时间的诱变，即诱变时间26 h，诱变浓度0.4%～0.5%，M2代突变频率高，但植株矮秆和畸形突变多，突变类型不丰富。王炜等［29］对甜高粱种子进行诱变，发现诱变的M2代植株中突变性状多以单株形式表现，且多为杂合突变体。因此，在构建突变体库时，可以考虑在M2代中，对突变体的鉴定集中于株高、穗型、叶型等表型的鉴定，选择表现优良、正向突变类型的植株标记编号，进而筛选品质、根系、抗逆等重要性状的突变体，加快突变体选择效率，为遗传改良提供种质资源材料。本研究中，M2代获得了较多有价值的突变，如早熟、分蘖、矮秆、紧穗等性状，可结合分子生物学技术，研究粒用高梁突变位点、相关性状功能基因定位，也可从生理生化等方向深入研究突变产生的机理，分析后代各变异类型的发生频率及遗传规律，提高突变体选择的准确性和利用效率［30-31］。

4 结论

本研究采用不同EMS浓度和时间处理粒用高梁亲本系种子发现，EMS 对高粱种子的影响随着EMS 浓度和诱变时间的增加而升高，同一处理水平下，两亲本对EMS的敏感性不同，2055B对EMS处理更为敏感。综合出苗率、结实率以及突变率，2055B 最佳诱变时间和EMS浓度为14 h+0.25%，10125为14 h+0.3%，同时初步构建了包含矮秆、紧穗、早熟等表型变异的高粱突变体库。