不同因素对早熟陆地棉离体胚成苗的影响

李春平，赖成霞，徐海江，张建国，玛依拉·玉素音，张大伟，魏 鑫，刘忠山

(1.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091，2.新疆海南良种繁育基地，乌鲁木齐 830006)

0 引 言

【研究意义】离体胚培养是将分离的胚在人工培养的条件下，直接诱导发育成苗。该项技术广泛应用于远缘杂交获得稀有杂种，单倍体的诱导，种子活力快速测定，特殊植物快速繁育等方面[1-5]。离体胚培养可以有效缩短作物育种时间，在棉花育种中有重要的应用潜力。离体胚培养省去种子成熟，休眠和萌发所需要的时间，可以加快作物世代繁殖，缩短作物育种时间，对品种培育具有重要意义。【前人研究进展】在培养基和胚龄对离体胚的成苗率研究方面，Borole等[6]利用添加不同浓度的生长素、细胞分裂素和赤霉素的BT培养基和MS培养基对(亚洲棉×陆地棉)F1杂交胚，胚龄为12、15、20、25DPA(days after pollination)的幼胚进行离体培养，发现20DPA成苗效果最好，BT培养基成苗要优于MS培养基，MS培养基中添加1.5 mg/L IAA，0.5 mg/L KIN和250 mg/L CH的处理只一株成苗，其它MS培养基处理组合均未成苗。叶春燕等[7]比较了不同的培养基、激素和胚龄等对棉花胚珠表皮纤维发育的影响，认为BT培养基较适合陆地棉胚珠的离体培养。徐莉等[8]筛选出适宜牡丹“凤丹”的培养基，“凤丹”的成苗率63.88%，成活率66.34%。徐阳等[9]研究了不同因素对甜柿幼胚的影响，影响大小依次为培养基、胚铃、柿品种、培养条件。幼胚胚龄增大，胚成苗率逐渐提高。离体胚成苗培养不仅受到培养基和胚龄的影响，也受到温度、光照的影响[10]。关丽霞等[11]研究了不同因素对后熟矮紫杉种子体胚萌发的影响，在白天温度23℃(10 h)、夜间温度13℃(14 h)的培养条件下，矮紫杉体胚萌发率可达94.44%。李丽等[12]研究了不同温度、光照时间和激素组合对伊贝母种胚诱导及植株再生的影响，发现温度为20℃，光照时间(12 h)为伊贝母种胚诱导最适宜条件，诱导率可达72.2%。【本研究切入点】目前，国内外对不同植物离体胚培养方面开展了大量的研究，该技术在加快世代繁殖，缩短育种时间等方面具有广泛应用价值[13]，但在早熟陆地棉方面研究相对较少。以往研究主要是基于无菌培养环境和成分复杂的培养基条件下开展的，由于培养基成分复杂、配制繁琐且对试验环境要求较高，限制了该技术在生产中的大规模的应用。在有菌水培条件下，建立一种操作简便、适宜大规模应用的棉花离体胚成苗技术。研究培养基、胚龄、温度和光照时间对棉花胚成苗的影响。【拟解决的关键问题】选用早熟棉新品系作为研究材料，研究不同因素对离体胚的成苗率、成苗时间、根系性状的影响及有菌、无菌培养污染发生特点。在菌水培条件下，分析早熟陆地棉离体胚成苗培养最适宜的胚龄、温度和光照时间条件，为大规模开展以离体胚成苗技术为核心的棉花1年多代研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

以早熟陆地棉新品系M319为试验材料，生育期120 d。2018～2019年，试验材料在玛纳斯县六户地镇试验田内种植。棉花离体胚培养分别在新疆农业科学院玛纳斯育种基地和新疆农业科学院经济作物研究所实验室内完成。

1.2 方 法

1.2.1 取 样

棉花第2、3果枝开花当日进行挂牌并登记开花日期，当胚龄达到15、20、25、30和35 d分别摘取棉铃进行离体胚的培养。

1.2.2 接 种1.2.2.1 MS培养接种(无菌培养)

棉铃先用自来水清洗表面，然后用吸水纸去除表面水分。在超净工作台内，用75%乙醇浸泡30 s，2次，用无菌水冲洗5～7次，15%H2O2消毒5 min，用无菌水冲洗3～4次，用无菌滤纸吸取表面水分，用灭菌解剖刀和镊子将胚取出，接种MS培养基上每瓶接种10粒，每个处理6瓶。

1.2.2.2 蒸馏水、普通水(自来水)培养接种(有菌培养)

操作为有菌操作，使用发芽盒、解剖刀等均不需要灭菌。棉铃表面先用清水洗去表面灰尘，然后用吸水纸去除表面水分，用刀片将棉铃切开，取出棉花胚用于培养。

离体胚培养的悬浮支撑物：选取5 mm左右厚度泡沫板，长宽可以根据发芽盒的大小确定；用打孔器在泡沫板上打孔，孔径直径大小根据胚的具体大小确定，以棉花胚根萌发部位接触水的表面，以不落入水为准，每个泡沫板打20个孔。

将自来水、蒸馏水倒入约发芽盒体积2/3位置即可，放入悬浮物，将棉花离体胚放入悬浮泡沫板孔洞内，用透明保鲜膜进行密封处理，然后放入光照培养箱进行培养。

1.2.3 试验设计1.2.3.1 不同培养基和胚龄条件下的离体胚成苗培养

采用双因素设计。其中培养基为3种：MS、普通水(自来水)、蒸馏水，其中MS为对照(CK)；胚龄胚为5水平：15、20、25、30和35 d，共计15个处理。MS培养每个处理设6个重复，蒸馏水和普通水培每个处理设4个重复。

光照培养箱培养条件：温度为28℃，光照时间为22 h，光照强度为12 000 lx。MS为无菌培养，蒸馏水和普通水为有菌培养。

1.2.3.2 光照时间、温度的离体胚培养

研究温度、光照时间对胚成苗的影响，试验采用双因素3水平设计，其中温度为28、30和32℃，光照时间为12、22和24 h，共计9个处理，每个处理4个重复。按照最佳胚龄的胚为试验对象，普通水为培养基，光照强度12 000 lx培养条件，将装有离体胚的发芽盒放入光照培养箱内进行培养。表1

表1 不同温度、光照时间处理

1.2.4 测定指标

成苗：离体胚的子叶90%面积变绿色即为成苗。

成苗时间：将装有离体胚三角瓶和发芽盒放入培养箱内开始到成苗的时间。

根系长度：从白色下胚轴开始测量根的长度。

根数：计量长度大于0.5 cm根的数量。

成苗污染率=污染株数/总株数。

1.3 数据处理

采用Excel2007、Spss19.0统计软件进行数据整理和分析。

2 结果与分析

2.1 离体胚的成苗污染

研究表明，有菌与无菌培养的菌类发生和生长的规律不同。普通水、蒸馏水培养属于有菌培养，在培养过程中离体胚死亡后菌类在其表面迅速大量繁殖，部分有损伤的成苗在其损失部位出现菌类大量繁殖的现象，并且水中出现少量的藻类，但是对成苗影响较小。水培条件下，20、25、30和35 d胚的平均成苗污染率分别为15.8%、5.0%、2.8%和0.6%。在离体胚的成苗期内，污染胚或成苗表面菌类大量繁殖，不会影响其它正常胚或成苗的生长和发育。CK培养属于无菌培养，培养瓶内污染速度快，4～5 d培养基和胚上全部长菌，严重影响胚的生长发育，最终导致胚或苗的死亡。

2.2 不同培养基条件下，胚成苗生长

研究表明，普通水、蒸馏水与CK培养条件下，相同胚龄的离体胚成苗后生长情况基本相同，不同胚龄之间生长差异较大。不同胚龄成苗具有以下特点：胚龄较小的胚成苗长势弱，下胚轴和根纤细，根数较少，子叶小而薄，叶色浅绿。胚龄较大的成苗健壮长势强，下胚轴和根系粗壮，子叶肥大颜色深绿。其中35 d胚成苗长势最强，叶色深绿，胚轴和根粗壮，根数量多。图1

图1 普通水培养成苗(从左到右依次为20 d、25 d、30 d、35 d胚)

2.3 不同培养基、胚龄对胚成苗率和成苗时间的影响

研究表明，不同培养基条件下，离体胚的成苗率之间差异达到显著水平，其中普通水与蒸馏水成苗率之间差异不显著，与CK成苗率达到显著水平，大小依次为CK>普通水>蒸馏水。虽然水培与CK成苗率相比存在极显著性差异，但是随着胚龄的增加相同胚龄的离体胚的成苗率差异逐渐减小，当胚龄为35 d时，3种培养基成苗率之间差异不显著。在普通水培养条件下，20、25、30和35 d离体胚成苗率分别比对照低50%、36.3%、8.7%和1.3%；蒸馏水条件下，20、25、30和35 d离体胚成苗率分别比对照低51.3%、38.8%、10.0%和1.3%，其中15 d胚成苗率为0。当胚龄大于30 d时，水培与CK的胚成苗率相差10%以下，且成苗率均在90%以上。水培可以用于胚龄大于30 d胚的成苗培养。

不同胚龄离体胚成苗率、成苗时间之间差异达到极显著水平(P<0.01)。水培条件下，35 d离体胚的成苗率最高达到98.8%，与其它胚龄成苗率的差异均达到显著水平，大小依次为35 d>30 d>25 d>20 d>15 d。不同胚龄的离体胚成苗率呈现随着胚龄的增加而增加的趋势。不同胚龄胚的成苗时间之间差异达到显著水平，成苗时间随着胚龄增加而减少，成苗时间大小依次为35 d<30 d<25 d<20 d，其中35 d成苗时间最短为11.1 d。水培养的离体胚的最佳胚龄为35 d。图2

图2 不同培养条件下胚的成苗率

2.4 不同培养基、胚龄对根长和根数的影响

研究表明，普通水与蒸馏水的成苗根长之间差异不显著，与CK成苗根长差异显著，其平均根长大小依次为CK>普通水>蒸馏水。不同胚龄胚的成苗根长之间差异达到显著水平，并且成苗根的长度随着胚龄增加而增加，其中胚龄35 d的成苗根最长。

胚龄是影响成苗根数的关键因素，影响达到极显著水平(P<0.01)。成苗的根数随着胚龄的增加而增加，并且不同胚龄之间的成苗根数差异达到极显著水平，根数大小35 d>30 d>25 d>20 d。表1，图1

2.5 温度、光照时间对胚的成苗率和成苗时间的影响

研究表明，不同温度条件下，胚的成苗时间差异达到显著水平，其中30与28、32℃条件下的成苗时间差异达到显著水平，28与32℃条件下的成苗时间差异不显著，成苗时间大小依次为30℃<28℃<32℃。30与28、32℃相比成苗时间分别缩短了0.8 和1.1 d。适宜的温度可以缩短胚的成苗时间。

不同光照时间条件下，成苗时间之间差异达到显著水平，大小依次24 h<22 h<12 h。光照时间越长，其成苗时间越短，其中光照时间24与12 h相比成苗时间缩短1.8 d，与22 h相比缩短了0.8 d，延长光照时间有利于缩短胚的成苗时间。

在不同处理中，T6成苗时间最短为9 d，与T3、T5成苗时间之间差异不显著，与T1、T2、T4、T7、T8和T9成苗时间之间差异达到显著水平。不同各处理成苗时间大小依次为T6

表2 不同温度和光照时间下35 d离体胚成苗时间变化

2.6 不同因素及处理对成苗胚根系性状的影响

2.6.1 不同因素及处理对成苗根长的影响

研究表明，在培养温度30℃条件下，成苗的根长最长，与32℃条件下的成苗根长差异显著，与28℃条件下的成苗根长差异不显著，根长大小依次30℃>28℃>32℃。30℃是最适宜根长发育的温度。

在培养光照时间12 h条件下，成苗的根长最长，与22、24 h条件下的成苗根长之间差异显著，22与24 h条件下的成苗根长之间差异不显著，根长大小依次为12 h>22 h>24 h。光照12 h是最适宜根长发育的光照时间。

T4处理的成苗根长最长，与其它处理成苗根长之间差异达到显著水平，大小依次为T4>T1>T5>T7>T2>T6>T3>T8>T9。T4培养条件较其它处理更有利于根的伸长，其培养温度为30℃，光照时间为12 h。表3

2.6.2 不同因素及处理对成苗根数的影响

研究表明，适宜的温度有利于增加成苗的根数，其中30℃条件下成苗的根数最多，与28、32℃根数差异达到显著水平，大小依次30℃>28℃>32℃。30℃时较其它温度更有利于根数增加。

不同光照时间的成苗根数差异达到显著水平，光照时间12 h条件下的成苗的根数最多，与22、24 h条件下的成苗根数之间差异显著，22与24 h条件下的根数之间差异不显著，根长大小依次为12 h>22 h>24 h。光照12 h与其它相比是根数的最佳光照时间。

T4处理的成苗根数最多，与其它处理成苗根数之间差异达到显著水平，大小依次为T4>T5>T1>T6>T7>T2>T3>T8>T9。T4培养条件与其它处理相比，更有利于根数的增加，其培养温度为30℃，光照时间为12 h。表3

表3 不同温度和光照时间下35 d胚的成苗根发育变化

3 讨 论

培养基和胚龄是离体胚成苗培养中的关键影响因素，对成苗率和成苗根系发育影响显著。时香玉等[14,15]对个棉花种间杂交胚珠进行培养，发现杂种胚珠适宜培养时期是授粉后4～6 d，2 d的胚珠培养易产生愈伤组织，成胚率低，8 d后幼胚败育或脱落。不同培养基胚珠培养获得的胚和成熟胚的频率不同，适宜杂种胚珠培养的培养基为：BT基本培养基+NH4Cl 1 000 mg/L+IAA 1.5 mg/L+KT 0.2 mg/L+GA 0.06 mg/L。胚珠产生胚和胚的萌发频率不仅与培养条件有关，与其杂交组合的亲本的生理特性也有很大关系。耿兴敏等[16]研究表明，杜鹃远缘杂交离体成苗培养中，不同培养基培养的胚成苗率存在差异，其中WPM(woody plant medium)培养基成苗率高于MS培养基，并且胚龄对杂交胚的萌发率及成苗途径均有显著影响。不同杂交组合最适宜拯救时间不同，幼胚容易形成愈伤组织，相对成熟胚容易形成苗。余小玲等[17]研究发现，不同培养基早食李胚成苗率差异较大，花后88 d胚在WPM培养基的成苗率比MS培养基上高1倍左右；胚的成苗率随着胚龄增加而升高，至果实成熟时成苗率可达26.0%。陈颖等[18]研究发现，不同银杏品种成熟离体胚在不同的培养基上培养，其成苗率、根长、苗高出现差异，不同培养基对成熟离体胚培养差异大于品种之间差异。王玉柱等[19]利用不同培养基对骆驼黄杏品种的不同胚龄进行培养，发现不同培养基和胚龄胚的成苗率不同，其中6种培养基中Tukey培养基为佳，胚成苗率随着胚龄增加而增加。

试验中研究发现，培养基、胚龄是离体胚成苗的关键因素，不同培养基、胚龄的成苗率差异达到显著水平(P<0.05)，不同胚龄的离体胚成苗时间存在显著差异(P<0.05)。虽然水培与MS培养的低龄胚成苗率差异显著，但是随着胚龄增加成苗率差异也逐渐减小。当胚龄为35 d时，水培与MS的胚成苗率相差仅为1.2%。这种情况出现主要是MS培养基可以提供低龄胚成苗所需物质，而普通水和蒸馏水则不能提供造成的。高龄胚由于子叶已经积累较多营养物质不需要从外界吸收大量的营养物质即可发育成苗，所以水培与MS的胚成苗率相差较小。对于不同胚龄胚，胚成苗率随着胚龄增加而逐渐增加，其成苗规律与前人研究结果一致。胚龄不仅对胚的成苗率产生影响，同时也对成苗时间、根长、根数产生影响。在不要求无菌苗情况下，水培法可以用于早熟陆地棉花胚龄为35 d胚的离体培养，其与MS培养相比是一种操作简单、经济高效离体培养方法。

徐显[20]研究发现，8月12日取胚龄为18、20、23和25 d胚培养均能成苗。8月19日所取的胚中只有23和25 d胚能够成苗。该阶段胚发育的平均温度，≥20积温均小于8月12日。胚龄确定幼胚作为离体培养指标是不可靠。试验中，培养的离体胚为棉花第2、3果枝的棉铃，并且35 d离体胚的成苗2年试验结果具有较好重复性，因此，早熟棉第2、3果枝棉铃的胚龄可以作为离体培养的参考指标。

温度、光照时间是胚成苗及生长关键条件之一。张肖等[21]认为光照虽然影响胚根的生长，抑制胚轴的伸长，但有利于子叶长度的增加和叶绿素的合成。低温和高温不利于胚根的伸长和子叶生长；黑暗条件下温度显著影响胚轴生长。杨菲等[22]研究发现在同样培养条件下，光照下红豆杉离体胚的萌发率略高于黑暗下的萌发率，光照更利于幼苗生长。

温度、光照时间是离体胚成苗时间的关键因素，不同的温度、光照时间离体胚成苗时间之间存在显著性差异(P<0.05)。适宜温度可以缩短离体胚成苗时间，有利于根长的生长和根数的增加。光照时间的延长有利于缩短胚成苗时间，但是不利于根系的伸长和根数的增加。

4 结 论

培养基、胚龄、温度、光照时间是影响离体胚成苗的关键因素。水培与MS培养条件下，胚龄35 d胚成苗率差异不显著；高胚龄、适宜温度和光照时间有利于离体胚的成苗和促进根系发育。在胚龄35 d、温度30℃、光照时间24 h的培养条件下，离体胚的水培成苗效果好，可作为早熟陆地棉离体胚成苗简化培养的适宜条件。