双醋瑞因介导软骨细胞焦亡修复骨关节炎软骨损伤的机制研究

袁 磊， 刘志元， 薛 涛， 杨 雷

(江苏省常州市武进人民医院南院骨科， 江苏 常州 213000)

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是最常见的关节炎类型，也是全球老年人致残的最重要的退行性关节病之一[1]。在全球范围内，2017 年 OA 影响了 3.03 亿人[2]，其中 9.6% 的男性和 18.0% 的 60 岁以上的女性患有 OA 症状。OA可以影响任何关节，尤其是影响膝、髋、手和脊柱，导致患者疼痛和残疾，并给社会带来经济负担。在 OA 中，骨骼变得更硬，吸收冲击载荷的能力降低，导致软骨承受更多压力。OA 的共同特征包括软骨损失、关节间隙变窄、肥大性骨改变[3]。OA最常见的症状是慢性疼痛。残疾和疼痛都会导致生活质量显著下降[4]。而双醋瑞因 (DCN) 被认为是一种结构修饰的 OA 药物，可特异性地阻碍人类单核细胞中的白细胞介素-1b (IL-1b)，对软骨的修饰具有重要作用 。DCN 通常用于管理 OA 症状，针对主要原因，从而阻碍疾病的进展。近年来国外研究结果表明，双醋瑞因能够很好地改善 OA 的症状和抑制 OA 的发展[5]。但双醋瑞因对于OA的作用机制并不明确，需要进行进一步的研究和探索。同时有研究报道，涉及肌腱损伤和肌腱愈合的各种基因和生长因子受 siRNA 和 microRNA (miRNA) 的调控，从而参与了 OA 的发生和发展[6]。研究miRNA在关节生理和病理中的作用，可为OA的诊断、预防和治疗提供参考[7]。miRNA 是小的单链 RNA，与多种疾病有关，如癌症、OA 和糖尿病[8]。据报道，miR-155 在脂多糖 (LPS) 诱导的炎症性关节软骨细胞中上调[9]。miR-155 通过调节相应的蛋白质参与细胞焦亡。SMAD 家族成员 2 (SMAD2) 在将细胞外信号从 TGF-β 超家族配体转运到细胞核中发挥重要作用，从而调节各种细胞过程，例如细胞分化、增殖和凋亡[10]。CircCDK14 通过促进 SMAD2 表达来预防 OA 。核苷酸结合结构域样受体蛋白 3 (NLRP3)/caspase-1 通路参与 NLRP3 介导的炎性细胞因子的焦亡、释放和成熟[11]。SMAD2/3通路的激活可以抑制NLRP3的转录，从而减少缺氧心肌细胞的焦亡。但目前还没有关于双醋瑞因能否通过调控miR-107/SMAD2Z轴影响aspase-1通路的激活，从而影响KOA软骨细胞焦亡的报道。本研究从基因角度推测了双醋瑞因与miR-107对KOA软骨细胞焦亡的作用机制，为KOA的治疗提供了可能。

1 材料与方法

1.1细胞培养与分组:软骨细胞获自北京泽平科技有限公司(中国北京)。使用含有20%胎牛血清(FBS; Gibco,USA) 的 DMEM 培养基，在37℃和5%CO2的潮湿环境中培养。本研究使用的细胞分组如下：Blank组(不经任何处理)；LPS组(用 1μg/mL LPS 处理 24 h)；LPS+mimics-miR-107组(用 1μg/mL LPS 处理 24 h后，将miR-107 mimics转染至软骨细胞内)；LPS+mimics-NC组(用1μg/mL LPS处理24h后，将mimics NC转染至软骨细胞内)；DCN组(用1μg/mL LPS处理24h后，用10-5moL/L的双醋瑞因处理72h)。其中miRNA模拟物(miR-107mimics)、miRNA模拟物阴性对照(miR-107mimics-NC)购自RIBOBIO(中国广州)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)进行细胞转染，48h后用于后续实验。

1.2酶联免疫吸附试验:通过离心管收集软骨细胞上清液，将其离心并转移到灭菌管中。接下来，使用LPS诱导的小鼠膝关节软骨细胞中炎症因子IL-1β(MLB00C，R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN，USA)和 IL-18(FK-KJ2900，FANKE)的释放水平进行测定。相应的Quantikine ELISA试剂盒。

1.3qRT-PCR分析:根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)提取总 RNA。使用 NanoDrop-1000(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 测量 RNA 浓度。然后根据制造商的建议进行cDNA合成。简而言之，使用 ReverAid First Strand cDNA 试剂盒(Thermo Fisher Scientific)结合miR-107引物对RNA进行逆转录(RT)。U6和GAPDH分别用作标准化 miR-107 和 SMAD2 表达水平的内部对照。逆转录反应后，使用 LightCycler 480 SYBR-Green I Master 和 LightCycler 480 实时 PCR 系统(均来自 Roche Applied Science)检测 miR-107 和 SMAD2 mRNA的表达。miR-107 和 SMAD2的相对表达量由2-ΔΔCt法计算所得。相关引物序列皆由上海英拜生物科技有限公司设计合成。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR中所用引物序列

1.4蛋白质印迹分析:使用 RIPA 裂解缓冲液匀浆来自细胞的总蛋白质。并且通过BCA蛋白质试剂(Sangon Biotech Co.,Ltd.，China，Shanghai)测定蛋白质浓度。如前所述进行蛋白质印迹。一抗如下：SMAD2兔多克隆抗体(ab280888，Abcam，USA，1∶1000)，Caspase-1兔多克隆抗体(ab138483，Abcam，UK，1∶1000)；二抗如下：山羊抗兔IgG H&L (HRP)(ab97051，Abcam，UK，1∶20000)。抗β-肌动蛋白抗体用作内参。使用 Bio-Rad 数码图像系统拍照并保存分析图片，采用Image J软件(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)对目的条带进行灰度值分析。

1.5荧光素酶报告基因测定:进行荧光素酶测定以鉴定miR-107和SMAD2之间的相互作用。WT-SMAD2或MUT-SMAD2分别用mimics-miR-107或mimics-NC通过Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen,Shanghai,China)转染到软骨细胞中。转染后使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)检测荧光素酶活性。

1.6统计学分析:本研究数据使用SPSS21.0(SPSS，Inc，Chicago，IL，USA)和GraphPad Prism 8.01(GraphPad Software Inc)统计学软件对数据进行统计分析和作图。连续变量的正态分布采用Kolmogorov-SmiRnov验证。数据以平均值±标准差表示，两组间比较采取独立样本t检验，多组间数据比较采用one-way ANOVA，事后检验采用Tukey's multiple comparisons test。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1在LPS诱导的小鼠KOA软骨细胞中miR-107低表达而SMAD2高表达:膝关节软骨细胞中的miR-107与KOA密切相关[9]。为探讨其机制，本研究通过LPS诱导小鼠膝关节软骨细胞，建立软骨细胞炎症模型(LPS组)。qRT-PCR的结果表明，与Blank组相比，LPS组miR-107的表达水平显著下调，而SMAD2的表达水平显著上调(图1A/B，均P<0.05)，Western blot的结果表明，与Blank组相比，LPS组SMAD2的表达水平显著上调(图1C，P<0.05)。上述结果说明在LPS诱导的小鼠KOA软骨细胞中miR-107低表达而SMAD2高表达，miR-107和SMAD2均可能参与了KOA的发生。

图1 在LPS诱导的小鼠KOA软骨细胞中miR-107低表达而SMAD2高表达qRT-PCR分别检测miR-107(A)与SMAD2(B)的表达水平；Western blot法检测SMAD2的表达水平(C)。细胞实验重复3次，数据以平均值±标准差表示，两组间数据比较采用t检验，*表示P<0.05

2.2miR-107过表达降低LPS诱导的软骨细胞焦亡:焦亡与炎症性疾病密切相关，在关节炎中起重要作用，抑制软骨细胞焦亡可以改善关节炎。为了探索miR-107是否可以调节LPS诱导的KOA软骨细胞焦亡，我们对miR-107在LPS诱导的KOA软骨细胞中进行了过表达。同时使用qRT-PCR检测软骨细胞中miR-107的表达。与LPS+mimics-NC组相比，LPS+mimics-miR组中miR-107表达上调(P<0.05)(图2A)，表明miR-107成功进行了过表达。随后，通过Western blot检测细胞焦亡相关蛋白Caspase-1的结果显示：与正常组相比，LPS组Caspase-1水平升高，而miR-107过表达后显着降低了Caspase-1水平(均P<0.05)(图2B)。最后，使用ELISA试剂盒检测细胞中炎症因子的水平。与正常组相比，LPS组IL-1β和IL-18水平升高，而miR-107过表达显着降低了促炎因子的释放(均P<0.05)(图2C/D)。简而言之，miR-107的过表达可以抑制LPS诱导的KOA软骨细胞焦亡。

图2 miR-107过表达降低LPS诱导的软骨细胞焦亡qRT-PCR检测miR-107(A)的表达水平；Western blot法检测细胞焦亡相关蛋白Caspase-1(B)的表达；ELISA检测炎症因子IL-1β(C)和IL-18(D)的表达。细胞实验重复3次，数据以平均值±标准差表示，多组间数据比较采用one-way ANOVA，事后检验采用Tukey's multiple comparisons test，*表示P<0.05

2.3miR-107靶向抑制SMAD2:为进一步探究miR-107与SMAD2的关系，我们首先通过starbase在线数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/)预测miR-107和SMAD2之间的结合位点(图3A)。随后通过双荧光素酶测定进行验证，结果表明，与共转染mimics-NC和SMAD-WT的正常小鼠膝关节软骨细胞相比，共转染mimics-miR-107和SMAD-WT的软骨细胞荧光素酶活性降低(P<0.01)，而用SMAD-MUT转染的软骨细胞中荧光素酶活性没有显着变化(图3B)。先前的一项研究表明，SMAD2 在关节炎中至关重要，并且在SMAD2敲低后可以抑制软骨细胞的增殖和迁移[10]。因此，采用qRT-PCR和Western blot检测软骨细胞中SMAD2的mRNA水平和蛋白水平(图3C/D)，结果表明：miR-107的过表达显着降低了SMAD2的水平(均P<0.05)。上述结果表明，SMAD2是miR-107的靶基因。

图3 miR-107靶向抑制SMAD2Starbase数据库预测miR-107与SMAD2(A)的靶向结合位点；双荧光素酶实验验证miR-107与SMAD2(B)的靶向关系；qRT-PCR(C)与Western blot(D)分别检测SMAD2的表达情况。细胞实验重复3次，数据以平均值±标准差表示，两组间数据比较采用t检验，*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4双醋瑞因可通过促进miR-107的表达降低LPS诱导的软骨细胞焦亡:最后，为探究双醋瑞因介导软骨细胞焦亡修复骨关节炎软骨损伤的机制，我们通过qRT-PCR和Western blot检测了miR-107以及SMAD2的表达情况，结果表明：与LPS组相比，DCN组的miR-107水平显著升高，SMAD2水平显著降低(图4A/B/C，均P<0.05)；此外，Western blot检测Caspase1的结果表明，与LPS组相比，DCN组的Caspase1蛋白显著升高(图4D，P<0.05)；同时ELISA试验的结果表明，与LPS组相比，DCN组的炎症因子IL-18与IL-1β均显著降低(图4E/F，均P<0.05)。上述结果表明双醋瑞因可通过促进miR-107的表达降低LPS诱导的软骨细胞焦亡。

图4 双醋瑞因可通过促进miR-107的表达降低LPS诱导的软骨细胞焦亡qRT-PCR分别检测miR-107(A)与SMAD2(B)的表达水平；Western blot法检测SMAD2的表达水平(C)；Western blot法检测细胞焦亡相关蛋白Caspase-1(D)的表达；ELISA检测炎症因子IL-1β(E)和IL-18(F)的表达。细胞实验重复3次，数据以平均值±标准差表示，两组间数据比较采用t检验，*表示P<0.05

3 讨 论

在本研究中，双醋瑞因通过过表达miR-107介导SMAD2下调从而调控Caspase-1的表达来抑制软骨基质降解，这为我们在药物开发中将基础研究成果转化为对患者的实际治疗，能够填补基础科学与临床科学之间的空白。而软骨退变常被认为是KOA进展的主要原因，软骨细胞功能的改善对KOA的恢复很重要。本研究采用LPS诱导的软骨细胞构建体外KOA模型。

经典的细胞焦亡主要依赖于炎症小体激活的Caspase-1，Caspase-1表达增加与NLRP3炎性体介导的细胞焦亡信号传导有关。此外，有研究报道[12]证明氧化的低密度脂蛋白和胆固醇晶体激活巨噬细胞中的NLRP3炎性体，进一步激活Caspase-1成熟的促炎因子(IL-1β和IL-18)，可诱导巨噬细胞焦亡。痛风关节炎是一种由尿酸钠(MSU)晶体或焦磷酸二水合物(CPPD)晶体引起的炎症性疾病。MSU和CPPD被NALP3炎性体识别以激活NALP3，然后激活Caspase-1以产生诱导炎症的成熟IL-1β和IL-18。在痛风性关节炎发作时，TLR4信号通路参与调节细胞焦亡。TLR4信号识别MSU并与MyD88相互作用激活NF-κB，从而调节pro-IL-1β的表达，将其切割成成熟的IL-1β诱导细胞焦亡。

Caspase-1的激活是细胞焦亡的核心。一项研究表明，针对NLRP3炎性体的抗炎疗法可能是治疗OA的一种新方法。有报道称，胶原性关节炎小鼠关节滑液中NLRP3、IL-18、IL-1β的表达明显升高，且NLRP3的表达与临床关节炎的严重程度相关。还有报道发现OA患者滑膜中的尿酸可通过激活NLRP3炎性体激活pro-IL-18和pro-IL-1β，并且滑膜中的IL-18和IL-1β与OA的严重程度呈正相关。因此，我们推测细胞焦亡可能参与了OA的过程。本研究发现LPS诱导作用下软骨细胞中炎症因子IL-1β、IL-18的表达增加，这一发现与之前的研究一致。此外，双醋瑞因导致Caspase-1表达增加，刺激软骨细胞焦亡。

近期，miRNA被证明对KOA发展具有一定的调节作用。据报道miR-107在OA中下调，且提高miR-107表达水平可以减轻软骨细胞损伤。在本研究中，在LPS诱导下，软骨细胞miR-107表达水平降低，SMAD2表达水平上升，而双醋瑞因处理使得软骨细胞miR-107及SMAD2表达水平都出现部分逆转。因此，我们猜测miR-107与SMAD2表达水平之间可能存在一定联系，随后通过starbase在线数据库及双荧光素酶实验预测并证明miR-107靶向调控SMAD2，这辅佐了miR-107过表达下调SMAD2表达以减少细胞焦亡并促进软骨细胞增殖的现象。此外，双醋瑞因处理同样降低LPS诱导的软骨细胞中IL-1β和IL-18的表达，以上现象皆说明双醋瑞因能通过促进miR-107的表达从而介导软骨细胞焦亡修复骨关节炎软骨损伤。