白果内酯调控细胞因子信号转导抑制因子2抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞中炎症与纤维化成分的表达

李晓艳， 莫立稳， 程 莹， 吴绮楠

(1.西部战区总医院， 四川 成都 6100312.重庆医科大学附属大足医院内分泌科， 重庆 402360)

糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症，是终末期肾功能衰竭的重要诱发因素。其特征是蛋白尿、肾小球滤过率下降、高血压、系膜基质扩张、肾小球基底膜增厚和肾小管间质纤维化[1]。糖尿病肾病进展的病理机制，包括炎症和纤维化。目前糖尿病患者的治疗策略主要是血糖控制和降压/降脂治疗；然而，这些措施对糖尿病患者的肾脏并不能起到保护作用。因此，开发针对糖尿病肾病的新治疗方法是一个非常重要的领域。银杏叶是世界上应用最广泛的植物治疗产品之一，其提取物对治疗糖尿病性心肌病、高血压、神经退行性疾病、白内障等多种疾病具有有益的特性。白果内酯是银杏叶提取物中的一种倍半萜，占2.9%-3.2%。研究表明，白果内酯通过调节多种信号通路在治疗高血糖脑缺血、氧化应激和神经保护作用中发挥重要作用[2，3]。白果内酯能降低非酒精性脂肪肝炎大鼠的α-平滑肌肌动蛋白阳性表达，减轻肝纤维化[4]。白果内酯可改善链脲佐菌素诱导的未成熟大鼠糖尿病肝损伤和代谢紊乱。然而，白果内酯在糖尿病肾病调节中的具体作用和机制尚不明确。因此，本研究使用肾小球系膜细胞系创建了高糖细胞模型，以评估白果内酯的治疗效果，并破解可能的抗炎和抗纤维化机制，以期为白果内酯在预防或控制糖尿病肾病中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料:人肾小球系膜细胞(HMC)(上海雅吉)，白果内酯(20mg，含量≥98%；北京Solarbio)，针对细胞因子信号转导抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)的小干扰RNA、小干扰RNA阴性对照(上海GenePharma)，SOCS2抗体、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗体、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗体、纤连蛋白(Fibronectin，FN)抗体、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)试剂盒、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒(美国Abcam)，Lipofectamine 2000、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白试剂盒、增强化学发光试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific)，ECL试剂盒(北京SBS Genetech)。

1.2细胞培养与高糖损伤:肾小球系膜细胞HMC在补充10%胎牛血清和1%青-链霉素的低糖DMEM培养基中常规培养，所处环境为37℃、5% CO2培养箱。为了模拟高糖环境，将肾小球系膜细胞HMC在含30mmoL/L葡萄糖培养基中刺激24h[5]。

1.3细胞转染:将对数期的肾小球系膜细胞HMC(5×105)接种于6孔板，转染时，使用Lipofectamine 2000，将针对SOCS2的小干扰RNA、小干扰RNA阴性对照分别转染肾小球系膜细胞HMC，即为干扰SOCS2组和NC组。转染24h后，通过Western blotting进行抑制SOCS2转染效率的检测。每个独立实验均重复3次。

1.4实验分组:实验共分为：NG组、HG组、HG+低白果内酯组、HG+中白果内酯组、HG+高白果内酯组、HG+高白果内酯+NC组和HG+高白果内酯+干扰SOCS2组。NG组肾小球系膜细胞HMC正常培养，NG组根据1.2进行高糖损伤，HG+低、中、高白果内酯组细胞分别在含6μmoL/L、12μmoL/L、24μmoL/L白果内酯[6]和30mmoL/L葡萄糖培养基中处理24h。HG+高白果内酯+NC组和HG+高白果内酯+干扰SOCS2组细胞分别转染小干扰RNA阴性对照、针对SOCS2的小干扰RNA 24h后，在含24μmoL/L白果内酯和30mmoL/L葡萄糖培养基中处理24h。

1.5Western blotting检测TGF-β1、CTGF、FN、SOCS2蛋白表达:肾小球系膜细胞HMC总蛋白使用RIPA测定缓冲液提取。用BCA蛋白试剂盒检测蛋白浓度。然后，将40μg蛋白样品上样到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，转移到聚偏二氟乙烯膜。之后，将膜用5%脱脂牛奶的TBST溶液在室温下封闭1h，用特异性抗体一抗(4℃下孵育过夜)、以及相应的二抗(室温下孵育1h)进行免疫印迹，最后通过ECL试剂盒进行检测。抗体为：TGF-β1抗体、CTGF抗体、FN抗体、SOCS2抗体(均1∶1000稀释)、对照GAPDH抗体(1∶2000)和辣根过氧化物酶标记二抗(1∶8000稀释)。

1.6ELISA检测TNF-α、IL-6表达:肾小球系膜细胞HMC经不同处理后，在3500r/min离心并收集上清液。根据TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒随附说明步骤，测量TNF-α、IL-6表达。TNF-α、IL-6表达通过检测450nm处的吸光度和标准曲线进行检测。

2 结 果

2.1白果内酯对高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞中纤维化成分的影响:与NG组相比，HG组肾小球系膜HMC细胞中纤维化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表达量均增加(P<0.05)；与HG组相比，HG+低、中、高白果内酯组肾小球系膜HMC细胞中纤维化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表达量逐渐减少(P<0.05)，并呈现剂量依赖性，见图1、表1。

表1 肾小球系膜HMC细胞中纤维化成分的检测

图1 白果内酯对肾小球系膜HMC细胞中TGF-β1、CTGF、FN蛋白表达的影响

2.2白果内酯对高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞中炎性因子的影响:与NG组相比，HG组肾小球系膜HMC细胞中炎性因子TNF-α、IL-6表达水平均升高(P<0.05)；与HG组相比，HG+低、中、高白果内酯组肾小球系膜HMC细胞中TNF-α、IL-6表达水平逐渐降低(P<0.05)，并呈现浓度依赖性。见表2。

表2 肾小球系膜HMC细胞中炎性因子的检测

2.3白果内酯对高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞中SOCS2表达的影响:HG组比NG组降低肾小球系膜HMC细胞中SOCS2的蛋白表达(P<0.05)；HG+低、中、高白果内酯组比HG组逐渐提高肾小球系膜HMC细胞中SOCS2的蛋白表达(P<0.05)，并呈现浓度依赖性。见图2、表3。

图2 白果内酯对肾小球系膜HMC细胞中SOCS2蛋白表达的影响

表3 肾小球系膜HMC细胞中SOCS2表达的检测

2.4抑制SOCS2转染效率的检测:肾小球系膜HMC细胞中转染SOCS2小干扰RNA后，干扰SOCS2组SOCS2的蛋白表达量比相应对照NC组减少了约59.74%(P<0.05)。见图3、表4。

图3 SOCS2蛋白表达的检测

表4 SOCS2转染效率的检测

2.5抑制SOCS2对白果内酯处理的高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞纤维化成分及炎性因子的影响:与HG+高白果内酯+NC组相比，HG+高白果内酯+干扰SOCS2组肾小球系膜HMC细胞的SOCS2蛋白表达量减少，TGF-β1、CTGF、FN蛋白表达量和TNF-α、IL-6表达水平均提升(P<0.05)，见图4、表5。

表5 抑制SOCS2对白果内酯处理的肾小球系膜HMC细胞纤维化成分及炎性因子的检测

图4 抑制SOCS2对白果内酯处理的肾小球系膜HMC细胞中相关蛋白表达的影响

3 讨 论

糖尿病肾病是一种以蛋白尿和肾小球滤过率下降为特征的慢性炎症性疾病。其中，系膜细胞功能障碍会促进糖尿病肾病发展，这是由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分的积累引起的。因此，本研究使用高糖处理的肾小球系膜细胞系对糖尿病肾病进行建模[7]，旨在揭示白果内酯在糖尿病肾病中的作用机制。

高糖会加速ECM在肾小球系膜细胞中的聚集，ECM的过度积累随后导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。TGF-β1已被确定为糖尿病肾病中ECM蛋白合成的关键调节因子，主要负责ECM的积累，与肾纤维化和肾小球硬化的发展密切相关。CTGF也可能通过抑制基质分解和诱导ECM合成而导致糖尿病肾病[8]。研究表明，高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞中TGF-β1、CTGF、FN的蛋白增加，而白果内酯的给药浓度依赖性的降低了肾小球系膜HMC细胞中TGF-β1、CTGF、FN的水平，延缓了纤维化的趋势。与黄茸茸等[6]提供的白果内酯抑制非酒精性脂肪肝炎大鼠肝纤维化的结果相似，提示白果内酯可作为治疗肾纤维化的潜在抗纤维化剂。

本研究通过检测炎性细胞因子，发现白果内酯可以降低高糖刺激的肾小球系膜细胞中TNF-α、IL-6的表达。白果内酯可下调葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠血清中TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的水平，减少阿尔茨海默病细胞和小鼠模型中TNF-α和IL-6释放以降低神经细胞中的炎症[9]。而且白果内酯降低了高糖诱导的肾小球系膜细胞中TNF-α、IL-6表达水平，呈现浓度依赖性。结果进一步证实了白果内酯在糖尿病中的抗炎作用，并显示了调节炎性因子在治疗糖尿病肾病中的潜在益处。

此外，白果内酯可拮抗高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞中SOCS2的蛋白表达降低，提示白果内酯可能通过调节SOCS2来控制糖尿病肾病的进展。SOCS2被认为是一种炎症反应调节剂，影响糖尿病肾病的发病机制[10]。为了确定白果内酯抑制炎性因子的潜在机制，在肾小球系膜细胞中转染针成功抑制SOCS2后，发现白果内酯对高糖诱导的肾小球系膜HMC细胞纤维化成分及炎性因子的抑制作用被逆转。因此可见白果内酯在高糖诱导的肾小球系膜细胞中具有的抗纤维化和抗炎特性可能归因于其对SOCS2的促进。

综上，白果内酯具有减弱糖尿病肾病并抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症和纤维化的特性。此外，白果内酯的抑制作用是通过上调SOCS2的表达来实现的，证明白果内酯可能潜在的应用于预防或治疗糖尿病肾病以及其他与炎症相关的糖尿病疾病。