miR-34b-5p通过Gab1调节mTOR通路抑制子宫内膜癌细胞的增殖迁移

田雪敏，石璐璐，董 辉，杨彩虹

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院医学科学研究院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院心脑血管病医院妇科，银川 750004）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是一种由持续的雌激素暴露、代谢异常、未育、遗传基因易感性等原因引起的女性生殖系统恶性肿瘤。目前，EC 发病率逐年增高，在中国女性生殖系统恶性肿瘤中居第二位，在发达国家排名第一[1]。研究[2]发现，有多种miRNAs 可参与EC 的诊断、治疗、预后等过程，为EC 的研究提供了新方向。miR-34 家族已被发现在多种癌症中表达异常，因其可以被肿瘤抑制基因p53 直接调控，故其被认为可以抑制肿瘤的发生[3]。miR-34b-5p 是miR-34家族成员之一，研究[4]表明，miR-34b-5p 可在多种癌症中表达，且抑制肿瘤的增殖、迁移、侵袭等生物学行为。Grb2 相关结合蛋白1（Grb2-associated binder 1，Gab1）是细胞的骨架蛋白，参与细胞形态的维持。Gab1 也可以作为信号通路中的“放大器”，通过激活通路促进肿瘤细胞的生长并抑制其凋亡[5]。miR-34b-5p 在子宫内膜样腺癌（endometrioid adenocarcinoma，EEC）淋巴结转移患者中显著下调，而在雌激素影响下，Gab1 在子宫内膜中的表达水平随月经周期发生改变[6-7]，推测miR-34b-5p、Gab1 可能与EC 的发生、发展有关，但关于二者与EC 的关系尚未见报道。通过Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）和miRDB（http://mirdb.org/）生物学预测网站发现，Gab1 是miR-34b-5p 的调控靶点。Gab1 基因是哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的上游分子，可以传递磷酸化基团至mTOR 通路，以引起mTOR 通路的激活，促进肿瘤的增殖和侵袭。鉴于此，本研究主要探究miR-34b-5p 调控Gab1 的表达，介导mTOR通路在EC 细胞——人子宫内膜腺癌细胞（human endometrial adenocarcinoma cells）AN3CA 中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

人子宫内膜腺癌细胞AN3CA（上海名劲生物科技有限公司）；DMEM 培养基（上海源培生物科技股份有限公司）；Certified Fetal Bovine Serum（FBS，Biological Industries 公司）；胰蛋白酶、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；引物miR-34b-5p（上海生工生物技术有限公司），引物U6（广州市锐博生物科技有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time，日本TaKaRa公司）；miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（SYBR Green，北京天根生化科技有限公司）；人子宫内膜腺癌芯片（31 例癌和癌旁，上海芯超生物科技有限公司）；慢病毒：miR-34b-5p 过表达慢病毒载体（HBLV-has-miR-34b-Null-ZsGreen-PURO）、空载慢病毒（HBLV-ZsGreen-PURO 过表达对照组）均购自上海汉恒生物技术有限公司。CCK-8 试剂盒（APExBIO 公司）；全蛋白提取试剂盒、BCA 试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；PAGE 凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司）；一抗：Gab1、p-s6k（Novus Bio 公司），p-4EBP、p-mTOR 等抗体（Cell Signaling Technology公司），二抗：山羊抗鼠、山羊抗兔（Cell Signaling Technology公司）。荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；AzureC300化学发光成像系统（AzureBiosystems 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、转染和分组 人子宫内膜腺癌细胞AN3CA 培养于含10%血清+1%双抗青霉素/链霉素的DMEM（高糖）培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞汇合度达到80%～90%时，胰酶消化2 min，离心，重悬，按2×105个/孔接种至6 孔板，常规培养。根据慢病毒转染说明进行转染，取空载、miR-34b-5p 慢病毒加入6 孔板，每孔加入1 mL 完全培养基，4 h 后补全，24 h后换液，48～72 h 观察荧光，96 h 加入嘌呤霉素（6 μg·mL-1），维持4 d。实验分为空白对照组（无处理，Control 组）、空载体组（转染无意序列空载病毒，Nc 组）、实验组（转染pre-miR-34b-5p 慢病毒，pre-miR-34b-5p 组）。

1.2.2 RT-qPCR 检测Gab1、miR-34b-5p 在组织中的表达及miR-34b-5p 在细胞中的相对表达量 购买上海芯超生物科技公司人子宫内膜腺癌芯片（31 例癌和癌旁），按试剂盒说明进行RTqPCR 实验，检测Gab1 和miR-34b-5p 在癌和癌旁组织中的相对表达量，Gab1 以β-actin 为内参，miR-34b-5p 以U6 为内参。收集Control 组、Nc组、pre-miR-34b-5p 组的细胞，用TRIzol 法提取总RNA，U6 下游引物、miR-34b-5p RT 代替试剂盒中引物，余按试剂盒说明将总RNA 逆转录为cDNA，将获得的cDNA 作为模板，进行RT-qPCR检测，操作按试剂盒说明进行，以U6 为内参。采用2－△△Ct法计算Gab1、mRNA 和miR-34b-5p 在各组的相对表达量，见表1。

表1 引物信息

1.2.3 Western blot 检测AN3CA 细胞中Gab1 和p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 的表达 用细胞刮刮取各组细胞，加入RIPA 裂解液剧烈振荡30 s，摇床上放置4 min，重复5 次（全程冰上操作），然后12 000 ×g，4 ℃离心15 min。BCA 蛋白含量检测试剂盒测定总蛋白含量。取30 μg 总蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，用湿转法转至PVDF 膜上。使用5%脱脂奶粉或5%的牛血清白蛋白（BSA）封闭90 min，加入特异性一抗Gab1（1∶2 000）、p-mTOR（1∶1 000）、p-s6k（1∶2 000）、p-4EBP（1∶2 000），β-actin（1∶5 000）作为内参对照，4 ℃过夜。次日，回收一抗，洗膜，加入二抗（1∶3 000），在室温下孵育1 h。用化学发光成像系统成像保存，Image J 分析Gab1、p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 灰度值，GraphPad Prism 软件进行统计分析。

1.2.4 双荧光素报告基因在293T 细胞中检测miR-34b-5p 与Gab1 的相关关系 针对miR-34b-5p 与Gab1 结合的种子序列区，构建Gab1-3’端UTR 的野生序列和突变序列，并购置miR-34b-5p 的合成序列（minics）和阴性对照序列（negative control，NC），取生长状态良好的293T细胞，将105个/孔的细胞接种至96 孔板中，使其第2 天汇合度达到50%～70%，将h-Gab1-3UTR、miR-34b-5p/NC 转染至283T 细胞中，分为4组：NC mimics+Gab1-3UTR-wt、miR-34b-5p+Gab1-3UTR-wt、NC mimics+Gab1-3UTR-mu、miR-34b-5p+Gab1-3UTR-mu，常规培养48 h 后，按照Promega Dual-Luciferase system 试剂盒说明进行检测。

1.2.5 CCK-8 实验检测过表达miR-34b-5p 的AN3CA 细胞增殖情况 取在对数生长期的AN3CA细胞，将103个/孔细胞接种于96 孔板，依据试剂盒说明书分组操作，每组设置5 个复孔，于培养箱内分别培养0、24、48、72、96 h 后，加入10 μL的CCK-8 溶液，继续培养2 h 后，用酶标仪测450 nm 波长处吸光度（A）值，计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=［（对照孔A 值-实验孔A 值）/（对照孔A 值-空白孔A 值）］×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.6 划痕实验检测过表达miR-34b-5p 的AN3CA 细胞迁移能力 在6 孔板每孔背面画5 条横线，取各组细胞5×105个接种于其中，培养过夜，用200 μL 的枪头垂直于背后的横线划痕，洗去划下的细胞。于48 h 后，取样拍照。用Image J 软件计算细胞迁移率，迁移率（%）=［（0 h 划痕宽度-48 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度］×100%。实验重复3 次，取平均值。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 26、GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，使用GraphPad Prism、Adobe Photoshop CS5、Image J 软件绘制图像。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gab1 和miR-34b-5p 在EC 及癌旁组织中的表达情况

RT-qPCR 实验结果显示，与癌旁组织相比，Gab1 在EC 组织中表达水平增高（t=6.900，P＜0.05），miR-34b-5p 在EC 组织中表达水平降低（t=6.495，P＜0.05），见图1。

图1 RT-qPCR 检测Gab1 和miR-34b-5p 在EC 和癌旁组织中的表达

2.2 在293T 细胞中检测miR-34b-5p 与Gab1 的相关关系

miR-34b-5p 与Gab1 的3’UTR 区具有2 个结合位点，序列模式见图2A。双荧光素酶报告实验结果显示，与NC mimics+Gab1-3UTR-wt 组相比，miR-34b-5p+Gab1-3UTR-wt 组的荧光素酶的表达水平下调（t=24.23，P＜0.05）；NC mimics+Gab1-3UTR-mu 组及miR-34b-5p+Gab1-3UTRmu 组的荧光素酶的表达水平差异无统计学意义（t=0.19，P＞0.05），见图2B。

图2 双荧光素酶实验检测miR-34b-5p 与Gab1 在293T 细胞中存在靶向结合关系

2.3 miR-34a-5p 慢病毒过表达AN3CA 细胞模型构建

miR-34b-5p 过表达慢病毒载体成功感染AN3CA 细胞，见图3A。Control 组、Nc 组、pre-miR-34b-5p 组miR-34b-5p cDNA 的相对表达水平分别为：（1.03±0.05）、（0.92±0.07）、（19.09±0.47），各组miR-34b-5p 表达水平差异有统计学意义（F=4371，P<0.05）。pre-miR-34b-5p 组miR-34b-5p 表达水平高于Control 组和Nc 组（t=61.20、70.58，P 均<0.05），提示miR-34b-5p 的过表达AN3CA细胞模型构建成功，见图3。

图3 miR-34b-5p 过表达慢病毒AN3CA 细胞模型构建

2.4 miR-34b-5p 过表达抑制AN3CA 细胞的迁移和增殖

划痕实验结果表明，各组细胞迁移率差异有统计学意义（F=72.26，P<0.05），与pre-miR-34b-5p 组相比，Control 组和Nc 组划痕宽度降低（t=10.52、13.17，P<0.05），见图4A、B。CCK-8 增殖实验表明，与pre-miR-34b-5p 组相比，其他两组在第3 天时细胞增殖上升（P<0.05），见图4C。

图4 miR-34b-5p 过表达抑制AN3CA 细胞的迁移和增殖

2.5 过表达miR-34b-5p 抑制AN3CA 细胞Gab1蛋白及p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 蛋白的表达

Western blot 结果显示，各组细胞中Gab1、pmTOR、p-s6k、p-4EBP 蛋白表达水平差异均有统计学意义（F=45.74、38.32、40.96、504.5，P 均<0.05）。与miR-34b-5p 过表达组相比，空白对照组（t=8.80、15.21、5.34、177.9，P<0.05）和空载体（t=5.73、8.07、14.57、8.96，P<0.05）组Gab1、p-mTOR、ps6k、p-4EBP 蛋白表达量均上升，见图5。

图5 miR-34b-5p 过表达抑制AN3CA 细胞Gab1 蛋白和p-mTOR 通路相关蛋白的表达

3 讨论

EC 是起源于子宫上皮细胞的生殖系统恶性肿瘤，早期EC 预后较好，但高级别、复发或转移性子宫内膜样腺癌预后较差[8]。故对于EC 的机制研究仍然很有必要。研究[9-12]表明，多种miRNAs 在EC 中呈现高表达或低表达水平，从而起到促癌或抑癌作用。在多种癌症中已得到证实，miR-34b-5p 可抑制癌细胞的生物学行为，例如，miR-34b-5p 可抑制肺癌的侵袭、肾癌的增殖、弥漫大B 细胞淋巴瘤的侵袭[13-15]。研究[16]表明，miR-34b-5p 是EC 治疗的关键标靶，但还未涉及其对EC 作用的具体机制研究。本课题组在EC组织中证实miR-34b-5p 低表达，为进一步研究miR-34b-5p 在EC 中的具体机制，本研究通过miR-34b-5p 过表达慢病毒转染AN3CA 细胞，构建了miR-34b-5p 过表达细胞模型，发现过表达miR-34b-5p 可以抑制EC 细胞AN3CA 的增殖和迁移，这与miR-34b-5p 在其他肿瘤中发挥的抑癌功能研究结果一致。

Gab1 在受体酪氨酸激酶、细胞因子受体和G 蛋白偶联受体激活后，可以调控受体下游的信号[17]，促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为[18]。本研究通过生信分析发现Gab1 是miR-34b-5p 的靶基因，双荧光素酶报告实验也证实了二者的靶向相关性。此结果与Qiu 等[19]在肺损伤模型中，证明miR-34b-5p 与Gab1 有靶向关系的结论相符。同时，EC 组织cDNA 芯片显示Gab1 过表达，与miR-34b-5p 的表达呈负相关，AN3CA 细胞中miR-34b-5p 过表达可使Gab1 蛋白的表达量降低，均证实了二者的互作关系。Gab1是多位点对接蛋白，通过协调参与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/细胞外调节蛋白激酶（ERK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号，参与肿瘤的发生、发展[20]。mTOR 为哺乳动物雷帕霉素的靶点，PI3K/Akt 和MAPK/ERK 信号通路可激活mTOR，从而激活下游分子4EBP1 和S6K1，进而增强蛋白质的合成，促进肿瘤的生长、增殖、迁移及肿瘤血管的生成[21]。本研究证实，miR-34b-5p 的过表达下调Gab1 的同时可抑制p-mTOR、p-s6k、p-4EBP 的蛋白水平，证实其磷酸化蛋白水平均下调，这或许解释了EC 细胞AN3CA 增殖和迁移被抑制的原因。

综上所述，miR-34b-5p 可以靶向抑制Gab1蛋白的表达，从而抑制p-mTOR、p-s6k、p-4EBP等磷酸化蛋白水平，抑制mTOR 通路从而抑制AN 细胞的增殖和迁移能力。在未来EC 的临床诊疗领域内，针对miR-34b-5p 靶点干预治疗可能成为新的诊疗手段和方式。