miR-K1-5p相关的G1/S期基因编码的蛋白在卡波西肉瘤中的表达

张 静，彭靖淇

（1.新疆医科大学附属中医医院病理科，乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院外科，乌鲁木齐 830000）

卡波西肉瘤主要是由卡波西肉瘤相关病毒（KSHV）感染内皮细胞引起的血管源性恶性肿瘤[1]。miRNAs 是一种非编码小分子RNA，通过结合靶基因的3'非翻译区（3'UTR）去降低或沉默靶基因的表达而发挥强大的调控作用。KSHV miRNA 也能通过复杂的机制诱导卡波西肉瘤的发生。课题组前期实验中通过对卡波西肉瘤miRNA 差异表达谱的筛选，证实卡波西肉瘤中miR-K1-5p表达明显上调[2]，进一步的体外实验发现在卡波西肉瘤细胞株中miR-K1-5p 可以促进G1/S 期转换，但其中的机制并不清楚。因此，本文检测miR-K1-5p 相关的G1/S 期基因编码的蛋白在卡波西肉瘤中的表达，以期为进一步研究miR-K1-5p对卡波西肉瘤细胞周期的调控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集新疆医科大学附属中医医院及市友谊医院存档的40 例卡波西肉瘤石蜡包埋块，以新疆医科大学附属中医医院40 例存档的血管瘤石蜡包埋块做对照（经医院伦理委员会批准实施，批件编号2019XE0133），由两名高年资病理医师独立阅片后纳入。卡波西肉瘤患者：男性35 例，女性5 例，年龄32～82 岁；血管瘤患者：男性24 例，女性16例，年龄1～80 岁。

1.2 主要试剂

免疫组化抗体均购自武汉博士德工程有限公司：细胞周期素依赖蛋白激酶抑制剂4（CDKN4）、细胞周期蛋白A（CCNA）、细胞周期蛋白D2（CCND2）、周期素依赖性激酶2（CDK2）、周期素依赖性激酶4（CDK4）。

1.3 筛选miR-K1-5p 的靶基因

通过生物信息软件miRDB 和TargetScan Custom 筛选miR-K1-5p 的靶基因。miRDB：www.mirdb.org；TargetScan: http://www.targetscan.org/vert_60/。

1.4 确定miR-K1-5p 和靶基因的信号通路，分析通路上关键基因

通过生物信息数据库Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析靶基因的信号通路及通路上的关键基因。

1.5 免疫组化（IHC）检测

切片放置65 ℃烤箱2 h；抗原修复，3%H2O2消除内源性过氧化物酶；加入CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 一抗，4 ℃过夜；二抗孵育；DAB显色复染，封片。

1.6 结果判断

随机选择10 个400 倍（直径0.05 cm）视野判读结果。1）着色情况：无着色为0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。2）阳性细胞数：1%～10%为1 分，11%～50%为2 分，51%～75%为3分，≥76%为4 分。两者相加的和＜3 分视为阴性表达，≥3 分视为阳性表达。CDKN4、CCNA、CCND2、CDK4 为肿瘤梭形细胞胞核着色；CDK2 以肿瘤梭形细胞胞浆着色为主，部分胞核着色。由两名高年资病理医师共同判读结果。

1.7 统计学方法

使用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计数资料组间比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman 秩相关分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-K1-5p 的靶基因

通过生物信息软件筛选CDKN4 基因为miRK1-5p 的靶基因，结合位点如表1所示。

表1 3'UTR of CDKN4 与miR-K1-5p 的结合位点

2.2 miR-K1-5p 与靶基因的信号通路和通路上的关键基因

通过生物信息数据库GO 和KEGG 分析：miR-K1-5p 和靶基因CDKN4 参与细胞周期信号通路，通路下游的关键基因为CCNA、CCND2、CDK2、CDK4。

2.3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤与血管瘤中的表达

卡波西肉瘤与血管瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表达情况见图1。CDKN4 在卡波西肉瘤中的阳性率低于血管瘤中的阳性率（P＜0.05）；CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中的阳性率均高于血管瘤中的阳性率（P均＜0.05），见表2。

表2 免疫组化检测CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表达［例（%）］

图1 免疫组化检测CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表达

2.4 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 与卡波西肉瘤患者性别、年龄的关系

不同性别、年龄卡波西肉瘤患者的CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 阳性表达率差异均无统计学意义（P 均＞0.05），见表3。

表3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 与卡波西肉瘤患者性别、年龄的关系［例（%）］

2.5 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表达的相关性分析

在卡波西肉瘤患者中，CDKN4 的表达与CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈负相关，CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表达互为正相关关系（P 均＜0.05），见表4。

表4 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表达的相关性（rs 值）

3 讨论

卡波西肉瘤是血管及梭形细胞增生伴侵袭特征的恶性间叶源性肿瘤[3]，分为经典型、艾滋病病毒（AIDS）相关型、非洲型及免疫抑制型。编码miRNA 的KSHV 是引起卡波西肉瘤最主要的致瘤病毒。miRNA 作为一类特殊的调控分子已受到科学界的广泛关注[4-7]，它们调控细胞的周期、增殖、凋亡、转移、侵袭等多种生物学行为，并广泛参与基因表达及细胞通路转导等[8]，与肿瘤学、病毒学等领域密切相关[9-10]。KSHV miRNA 也可以通过沉默转录因子、调控宿主细胞的周期等不同途径诱导卡波西肉瘤的发生。Wu 等[11]对卡波西肉瘤及瘤旁组织行RTq-PCR 检测后，发现包括miR- K1-5p 在内的13 个KSHV miRNA 在卡波西肉瘤中表达均上调，推测KSHV miRNA 扮演促癌角色[12]。进一步的细胞功能实验证实miRK1-5p 能够缩短细胞周期，加速细胞增殖，推测miR-K1-5p 可能与细胞周期的调控密切相关。

由于miRNA 通过影响靶基因的翻译而发挥其生物学作用，因此研究miRNA 功能的核心是寻找靶基因。本研究通过基因软件筛选CDKN4为miR-K1-5p 的靶基因，通过基因数据库分析靶基因参与细胞周期信号通路，通路下游的关键基因为CCNA、CCND2、CDK2、CDK4，它们编码的蛋白在细胞周期中发挥重要作用。细胞周期有G1/S 期和G2/M 期两个重要检查点，从细胞周期进程来看，G1/S 期的检查点比G2/M 期更重要。CDKN4 属于细胞周期非特异性抑制蛋白，是G1期负性调控蛋白，通过与CCN-CDK 复合物结合并抑制其活性，发挥阻碍G1/S 期转化和细胞增殖的作用，避免DNA 错误复制[13-15]。CCNA 在G1晚期表达，CCND2 在G1 期早期表达[16-17]，CDK2和CDK4 是G1 期-S 期转变的主要限速因子，形成CCNA/CDK2 及CCND2/CDK4 复合物后促进G1/ S转化[18-19]。因此，CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 是调控G1/S 期转换的5 个重要蛋白，其表达异常可能导致肿瘤的发生。

本研究使用免疫组化的方法在卡波西肉瘤（血管瘤为对照组）中检测CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 的表达情况。血管瘤是血管源性的良性肿瘤，全身任何部位均可发生，大体上形成境界较清楚的蓝-紫-红色的斑点或结节，光镜下由大小不等的血管腔构成；卡波西肉瘤是血管源性的恶性肿瘤/肉瘤，多发生在四肢，初为蓝-红色的斑片（斑点），后形成斑块及结节，光镜下以梭形细胞增生及血管之间含有红细胞的狭缝状腔隙为特点。血管瘤与卡波西肉瘤是组织起源相同的良恶性肿瘤，大体形态及镜下特征均有相似之处，具有良好的可比性。本研究发现：与血管瘤（对照组）相比，CDKN4 在卡波西肉瘤中表达下调；CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中表达上调。在卡波西肉瘤中CDKN4 的表达与CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈负相关，CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表达互为正相关，推测在卡波西肉瘤中miR-K1-5p 靶向CDKN4 使其表达明显下调，减弱了对CCNA/CDK2、CCND2/CDK4的抑制作用，引起其表达上调（CCNA 与CCND2的过度表达可导致CDK2 和CDK4 的激活），损伤G1/S 关卡，引起细胞增殖、周期紊乱，导致肿瘤发生。在卡波西肉瘤中，CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 与患者的性别、年龄均无关，可能与它们在卡波西肉瘤发生中功能的复杂性有关。

综上所述，卡波西肉瘤中，CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的异常表达可能在肿瘤的发生、发展中起重要作用。CDKN4 的表达下调和CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的过度表达可作为引起卡波西肉瘤细胞周期异常的生物学指标，其分子机制可能与CDKN4/CCN/CDK 通路有关，而它们作为G1/S 期相关的重要蛋白，有望成为卡波西肉瘤的治疗靶点。