二甲双胍对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响及机制

曹 鹏，王运帷，官 浩，陈 阳，任丽颖，姚 明

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院烧伤整形美容科，银川 750004；3.空军军医大学第一附属医院全军烧伤中心烧伤与皮肤外科，西安 710032）

烧伤或创伤是临床上常见的一种病症，重度烧伤或创伤会引起一系列皮肤和全身系统的病理生理变化。瘢痕组织是烧伤或创伤后创面修复的必然产物，据估计，有超过70%的人在烧伤或创伤后会形成增生性瘢痕[1-2]。增生性瘢痕在形成过程中常伴有瘙痒、疼痛、挛缩等症状，出现在关节活动部位的瘢痕甚至会影响关节的活动，给患者及家人带来沉重的心理和经济负担[2-4]。近年来，增生性瘢痕的治疗和预防方法取得了明显的进展，但对于增生性瘢痕的发病机制目前尚不明确。既往研究[1，5-6]表明，创面愈合和瘢痕形成与转化生长因子β1（TGFβ1）有关。TGFβ1/Smad 信号通路调节胶原合成，在瘢痕形成过程中起重要作用，调控TGFβ1/Smad 对抑制瘢痕增生十分重要。二甲双胍是临床上广泛应用的一种糖尿病经典治疗药物，具有抑制肝脏糖异生、增强骨骼肌葡萄糖摄取的作用。作为一种双胍类口服降糖药广泛应用于2 型糖尿病患者。研究[7-8]发现，二甲双胍还具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和减少许多器官纤维化的功能，可通过促进肌成纤维细胞的失活和凋亡而降低肝脏和肾脏纤维化的作用。目前关于二甲双胍用于增生性瘢痕的研究尚未见报道，本研究以原代培养的增生性瘢痕中成纤维细胞为研究对象，给予不同浓度的二甲双胍进行干预，检测各组细胞中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 和CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 及TGFβ1/Smad 信号通路的磷酸化水平，初步探讨二甲双胍通过TGFβ1/Smad 信号通路抑制瘢痕增生的机制，为增生性瘢痕的预防、治疗及药物筛选提供新的靶点和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2021—2022年在空军军医大学第一附属医院烧伤与皮肤外科接受治疗并手术的增生性瘢痕患者，标本经手术切除获得，所有患者均知情同意。本组共4 例，男性2 例，女性2 例，年龄18～35 岁。其中2 例位于上肢，2 例位于下肢。4 例患者均无其他系统性疾病，手术前均未接受任何药物注射、放疗或外科治疗，符合实验要求标准[9]。

1.2 主要试剂

1 mol·L-1二甲双胍购自西安灏洋生物技术有限公司；DMEM 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自美国Gibco 公司；兔抗人β-actin、TGFβ1、Smad3、p-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA 多克隆抗体购自Abcam 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购于北京博奥森生物技术有限公司；PMSF、RIPA裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自江苏碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜购自美国密理博公司；RIPA 裂解液均购自北京索莱宝生物科技有限公司；TRIzol Reagent 购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、荧光染料试剂盒均购自日本Takara 公司；SDS-PAGE 凝胶试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；DU800 型分光光度计购自德国贝克曼库尔特商贸有限公司；Mini 型蛋白电泳系统、电转印系统均购自美国Bio-Rad 公司；M200 型全波段酶标仪购自瑞士Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 采用组织块贴壁培养法培养成纤维细胞。将增生性瘢痕组织标本在无菌条件下用无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗3 遍，用手术刀片尽量除去表皮及皮下组织，再次用无菌PBS冲洗后，切成1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，间隔约1 cm 的距离在培养瓶壁上均匀摆置，加入适量完全培养基（含体积分数10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素、10 g·L-1链霉素的DMEM 培养基），接种至底面积为75 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶使组织块贴壁处朝上，于37 ℃、5%CO2的培养箱中孵育24 h 后，轻轻翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中静置培养，每周换液3 次。倒置显微镜下观察，待原代培养的成纤维细胞爬出，生长融合至80%～90%时，用0.25%胰酶消化传代培养。取第3～6 代成纤维细胞（Fb）进行后续实验。

1.3.2 实验分组 将实验细胞分为空白对照组和实验组，实验组依据二甲双胍浓度分为5、10、20、30 mmol·L-1组，观察各组给药刺激24 h 后细胞形态变化。空白对照组加入等体积的PBS 培养液。成纤维细胞以每孔2×105接种于6 孔板，每组设置3 个平行复孔，分别检测。

1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖 取对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞，0.25%胰酶、0.02%EDTA溶液消化细胞，离心收集细胞沉淀，用不含血清的DMEM 高糖培养基重悬细胞制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×107个/L，接种于96 孔板中，每个孔板接种细胞5 000 个，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h，弃去培养液，按实验分组加入不同浓度的二甲双胍的培养液，空白对照组加入等体积的培养液，每孔设置3 个复孔。在加药培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 液，37 ℃继续孵育2 h，酶标仪测定450 nm 波长吸光度（A）值，按照CCK-8 试剂盒说明书计算细胞抑制率。

1.3.4 实时荧光定量反转录PCR（qRT-PCR）法检测增生性瘢痕成纤维细胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA 的相对表达 按总RNA 提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA；紫外分光光度计检测提取RNA 的纯度及浓度，选取A260/A280在1.8～2.0 的组织提取物进行进一步实验。cDNA逆转录合成参照Takara 反转录试剂盒说明书；CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA mRNA 序列取自美国基因库，引物采用Primer Premier 5.0 软件设计，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及产物大小见表1。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，采用△循环阈值（Ct）法处理结果，计算CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 的相对表达量，即2-△△Ct。

表1 引物序列及产物大小

1.3.5 Western blot 法检测增生性瘢痕成纤维细胞TGFβ1、Smad3 磷酸化水平、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和α-SMA 蛋白的相对表达水平 空白对照组以及用5、10、20 和30 mmol·L-1二甲双胍分别刺激细胞48 h 后均进行RIPA 裂解，收集空白对照组及各实验组细胞。采用含有1 mmol·L-1PMSF的RIPA 蛋白裂解液冰上裂解细胞，提取总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度，测定后加入1/4 样品体积量的上样缓冲液，100 ℃金属浴10 min 后室温备用。调整电泳参数为：浓缩胶80 V、30 min，分离胶120 V、65 min。取出凝胶后湿转法转PVDF膜，脱脂牛奶封闭2 h。抗TGFβ1 抗体、抗Smad3抗体、抗磷酸化Smad3（p-Smad3）抗体、抗CollagenⅠ抗体、抗Collagen Ⅲ抗体、抗α-SMA 抗体（稀释比均为1∶1 000），抗β-actin 抗体（稀释比为1∶3 000），4 ℃摇床过夜。TBST 洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG 抗体（稀释比为1∶3 000），37 ℃摇床孵育1 h。TBST 洗涤后，ECL 发光，应用Image J 图像分析系统（美国国立卫生研究院）测定各蛋白条带灰度值，以β-actin为内参照，结果以目的蛋白与β-actin 的灰度比值表示，计算TGFβ1、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的相对蛋白表达量；Smad3 磷酸化水平=p-Smad3 相对表达量/Smad3 相对表达量。

1.4 统计学方法

使用Excel、GraphPad Prim 8.0 软件对数据进行统计分析。计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用Turkey检验进行单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较行Student-t 检验。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组增生性瘢痕组织细胞形态学变化

实验组细胞数目较少，排列较稀疏，且呈剂量依赖性，细胞体积较小，呈长梭形，核小，轮廓清楚；空白对照组细胞数目较多，排列紧密，细胞体积较大，呈星形扁平细胞，核大，轮廓清楚（图1）。

图1 各组增生性瘢痕组织细胞形态学变化

2.2 二甲双胍对增生性瘢痕组织成纤维细胞增殖活力的影响

空白对照组细胞生长无抑制，不同浓度二甲双胍处理成纤维细胞后，各实验组成纤维细胞的抑制率依次升高为（52.54±1.56）%、（66.12±1.15）%、（73.00±0.17）%和（79.65±1.18）%，均高于对照组（P 均＜0.05），抑制率随着二甲双胍剂量的增加而增加，呈剂量依赖性（图2）。

图2 二甲双胍对增生性瘢痕组织成纤维细胞增殖活力的影响

2.3 不同浓度二甲双胍对成纤维细胞CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 相对表达的影响

经不同浓度二甲双胍处理后，成纤维细胞中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA 相对表达水平随二甲双胍剂量的增加而降低，均低于空白对照组（P 均＜0.05），且呈剂量依赖性（图3）。

图3 不同浓度二甲双胍对成纤维细胞Collagen I、Collagen III 和α-SMA mRNA 表达的影响

2.4 不同浓度二甲双胍对成纤维细胞TGFβ1、Smad3 磷酸化、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA蛋白相对表达的影响

经不同浓度二甲双胍处理后，成纤维细胞中TGFβ1、Smad3 磷酸化、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 的蛋白相对表达水平均随着二甲双胍浓度的升高而降低，且呈剂量依赖性，均低于空白对照组（P 均＜0.05）（图4）。

图4 不同浓度二甲双胍对成纤维细胞TGFβ1、Smad3 磷酸化、Collagen I、Collagen III、α-SMA 的蛋白表达的影响

3 讨论

深度烧伤或创伤患者创面的愈合往往导致增生性瘢痕的形成。HPs 是一种严重的皮肤纤维化疾病，其临床特征主要表现为局部增厚、表面隆起呈红色、质硬无弹性、局部痒痛等；其形态结构特征主要表现为真皮成纤维细胞的过度增殖，成纤维细胞向肌成纤维细胞的过度转化，细胞外基质的过度合成、分泌、沉积、代谢，皮肤组织修复再塑功能受损[4，10-12]。HPs 不仅影响美观，还可能出现瘙痒、疼痛等症状，挛缩后甚至能引起组织器官的功能障碍，危害患者的生理和心理健康，给患者、家庭、社会造成了沉重的负担[2-4]。随着科学技术的快速发展，增生性瘢痕的治疗和预防方法也取得了很大的进步，但目前尚缺乏彻底有效的预防及治疗方案，主要原因是HPs 发病机制尚不明确。尽管临床上有多种治疗方案，但因HPs 的发病率及复发率高、周期长等特点，加之目前尚未有预防瘢痕形成及瘢痕改善的特效药物，因此，深入寻找预防及治疗增生性瘢痕的药物，初步推测其机制，并在此基础上探索防治新策略，是烧伤整形外科医生关注的热点和重点问题。

Smad3 是TGFβ1/Smad 信号通路中的一个重要中间信号分子，它的主要作用是介导TGFβ1信号传入细胞核内，并进一步影响相关下游基因的表达，它的高表达与瘢痕增生形成有着密切关系[13-15]。CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、α-SMA 是最常用于瘢痕检测的指标之一。CollagenⅠ是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要成分，在增生性瘢痕的形成过程中CollagenⅠ和Collagen Ⅲ均有增加，胶原的过度沉积与增生性瘢痕的形成有着紧密联系[5，16]。α-SMA 在肌成纤维细胞收缩、瘢痕挛缩和伤口过度愈合的过程中起关键作用[5，17]。

二甲双胍是一种双胍类口服降糖药，广泛应用于2 型糖尿病患者；具有抑制肝脏糖异生，增强骨骼肌葡萄糖摄取的作用[18]。并且二甲双胍还具有很强的抗炎、抗氧化、抗肿瘤和减少许多器官的纤维化功能，已有研究[19-21]表明二甲双胍通过促进肌成纤维细胞的失活和凋亡而降低肝脏和肾脏纤维化的作用。目前也有研究[22]发现二甲双胍可以通过抑制TGFβ1/Smad 信号传导来减少心脏纤维化的发生。

本实验应用CCK-8 法检测不同浓度二甲双胍对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制程度与浓度的关系，qRT-PCR 和Western blot 技术检测不同浓度二甲双胍对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、胶原合成及TGFβ1/Smad 信号通路的影响。结果表明：二甲双胍可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的细胞增殖和胶原合成，并且呈剂量依赖性。同时，本课题组还检测了TGFβ1 和Smad3 磷酸化蛋白表达水平，经不同浓度二甲双胍作用后，TGFβ1 和Smad3 磷酸化蛋白表达水平降低。由此推测二甲双胍可能通过TGFβ1/Smad 信号通路来抑制增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成，进而抑制增生性瘢痕的形成。

综上所述，二甲双胍对于增生性瘢痕的形成具有抑制作用，为临床上治疗和预防增生性瘢痕的形成及药物选择提供新的思路和方向，为进一步深层次研究提供理论指导。