脂联素对骨质疏松大鼠椎体磷酸钙骨水泥强化后骨质量及生物力学的影响及机制

张鑫，马朋朋，刘肃，李伟，张麦粒，赵立春，张春玲

(河北北方学院附属第一医院骨外科，河北 张家口 075000)

骨质疏松性椎体压缩性骨折是骨质疏松症的常见并发症之一，临床常用经皮椎体成形术及后凸成形术进行治疗[1]。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是近些年用于经皮椎体成形术及后凸成形术的新型骨水泥，具有生物相容性、骨传导性、骨诱导性良好及固化过程中放热慢、升温小、不易产生热损伤的优势，但也存在机械强度不足、黏结性较弱的缺点，进而限制了该材料的临床应用[2-3]。因此，增强CPC强化椎体的骨质量及生物力学强度具有重要意义。脂联素(adiponectin，APN)是具有广泛生物学作用的细胞因子，骨代谢相关的研究证实APN具有加速成骨、抑制破骨的作用，在骨折愈合过程中能够促进骨痂形成、骨微结构重建[4]。本研究将使用APN增强CPC强化椎体的骨质量和生物力学强度，具体观察APN对骨质疏松大鼠椎体CPC强化后骨质量及生物力学的影响及分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料 12周龄雌性SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物实验经医院伦理委员会批准，操作过程遵循3R原则。

APN购自美国Sigma公司，动物组织RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化公司，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)特异性一抗购自Abcam公司，磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38MPAK，p-p38 MAPK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK，p-JNK)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2)特异性一抗购自CST公司。

双能X线骨密度仪(XR-46型)购自美国Norland公司，小动物高分辨显微CT(VENUS型)购自上海平生医疗科技公司，荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪购自美国Bio-rad公司。

神经元受炎症刺激会出现持续性遗传放电现象或者自发放电现象，周敏化由此产生；一方面，周围炎症因子作用下会产生该效应，神经元自身离子通道改变是主要原因，比如，外周神经元损伤后，背根神经节的钠离子通道电流强度会增高，而钙离子与钾离子电流强度却会降低甚至消失，这些变化都会降低神经元膜电位，提升细胞兴奋度，并会向脊髓背角传导，将突触传递反应增加，使得一系列的痛觉敏化反应增强。另一方面，受炎症因子刺激，激活了P2X3受体、NMDA受体磷酸化，引起一系列的病理反应在受体活性与表达上，神经元本身会出现变性与坏死现象，这些都作为病理基础促使外周与中枢痛敏形成[1]。

1.2 方法

2.3 APN对CPC强化椎体中成骨标志基因表达的影响 采用荧光定量PCR检测CPC强化椎体中成骨标志基因ALP、OCN、OPN的mRNA相对表达量，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体中ALP、OCN、OPN的mRNA相对表达量及蛋白表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

1.2.5 蛋白相对表达水平的检测 另取CPC强化的椎体组织约20 mg，加入裂解液并在冰上研磨组织、提取组织蛋白，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测蛋白浓度，根据检测结果将30 μg蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶内进行电泳，使不同分子量的蛋白质分离后电转移至硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1 h，1∶1000稀释的ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2特异性一抗或1∶5 000稀释的β-actin特异性一抗4℃孵育NC膜过夜。次日室温孵育1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶二抗1h，最后在凝胶成像系统中进行化学发光，得到ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2、β-actin的条带，根据蛋白条带灰度值，以βactin为内参计算ALP、OCN、OPN、p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2的蛋白相对表达水平。

用于骨质疏松造模的剩余30只大鼠进行分组，分为对照组、1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组，均进行CPC强化，方法如下：以两侧髂后上棘连线与后正中线交点为中心、做长度2 cm的纵形切口，显露第4腰椎的侧壁，用3 mm直径的钻头垂直打孔5 mm，经打孔隧道注射CPC 0.1 mL，缝合切口。7 d后1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组分别给予1 mg/kg、2 mg/kg APN局部注射，对照组给予等剂量生理盐水局部注射，经打孔隧道部位进针，在注射CPC周围椎体进行局部注射，每日1次，连续8周。

乍一听“头脑”的名称，我还以为是用“筋头巴脑”为主要食材做的炖菜，结果亲口品尝时才发现，“头脑”是一道没有半点筋头巴脑的滋补汤！——我犯了典型的“顾名思义”错误！太原古城拥有灿烂的饮食文化，而“头脑”便是古城久负盛名的一道独特美食。

法团主义路径的核心观点认为，社区治理是城市社会治理体系的一部分，社区建设是国家政权建设的一部分，社区治理是以国家为主、社会为辅，国家吸纳社会构成的一种治理体系。在社区治理改革过程中，国家其实从未(也不可能)退场，只是改变了控制社会的策略——从单位社会时期的一统控制转向国家的“择机介入”。②当前，国家通过社区建设将权力下沉到基层社会和社区，将作为社会自治组织的居委会吸纳入政府体制，通过体制内部的权力优化重组来推进社会治理和发展。

1.2.3 强化椎体骨生物力学强度的检测 完成骨质量检测后将第4腰椎进行去除附件、两端椎间盘组织、打磨椎体上下两个底面的操作，使底面与椎体纵轴垂直，而后将椎体放置在万能材料试验机中进行压缩实验，与椎体纵轴平行的方向加载应力、加载速度为2 mm/min，记录压缩中心的荷载和变形情况，计算最大符合及刚度。

2.1 APN对CPC强化椎体骨质量的影响 采用双能X线骨密度仪测量CPC强化椎体的骨密度水平，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体的骨密度水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

10月19日，广西民族音乐博物馆在南宁正式开馆，这是广西首个专题性的音乐博物馆。该馆设立于广西艺术学院南湖校区，是广西壮族自治区政府立项建设项目，旨在弘扬广西民族音乐文化、探寻中国南方少数民族与东南亚民族音乐文化的共源性、推动中国与东南亚国家音乐文化深度交流。

如图3所示，在小车移动过程中，1号点至6号点作为第一层停留点，7号点到18号点作为第二层停留点，以此类推.其中，标号为p的停留点(p=1,2,…,M)，由3k2+3k+1≥p>3k2-3k+1知，其所处层数

1.2.2 CPC强化椎体骨质量的检测 处死大鼠后解剖第4腰椎，剥离周围软组织后放置在双能X线骨密度中，按照扫描宽度20 nm、扫描速度7 mm/s对骨密度水平进行测量。然后将第4腰椎放入小动物高分辨显微CT中，按照15 μm的分辨率进行扫描，得到图像后测量骨小梁体积分数(bone volume to total volume，BV/TV)、平均骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、平均骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)。

2 结 果

1.2.4 mRNA相对表达水平的检测 完成压缩实验后，取CPC强化的椎体组织约20 mg，采用组织RNA提取试剂盒提取组织中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒将组织中提取得到的RNA反转录为cDNA，采用荧光定量检测试剂盒对cDNA中的ALP、OCN、OPN进行荧光定量PCR检测，PCR的体系为：cDNA 1 μL、莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒(moloney murine leukemia retrovirus，MMLV)反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL，去离子水补足至20 μL；PCR的反应程序为：95℃预变性3 min，95 ℃ 15 s、特异性退火温度25 s、72 ℃ 30 s，共进行40个循环的荧光定量PCR反应，反应结束后得到循环曲线及循环阈值(Ct)，以β-actin为内参、按照公式2-△△Ct计算ALP、OCN、OPN的mRNA相对表达水平。

采用显微CT扫描观察骨微观结构，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体的BV/TV、Tb.N、Tb.Th水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1，见图1)。

表1 三组间CPC强化椎体骨密度及骨微观结构CT参数的比较

图1 三组CPC强化椎体的CT图像

2.2 APN对CPC强化椎体生物力学的影响 采用椎体压缩实验评价CPC强化椎体的生物力学特征，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体的最大负荷、刚度均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 三组间CPC强化椎体生物力学参数最大负荷、刚度的比较

1.2.1 动物造模及给药 随机选择10只大鼠，处死后解剖第4腰椎、测量骨密度。剩余40只大鼠均进行骨质疏松造模，方法如下：异氟烷麻醉后摆放仰卧位，做腹正中切口，打开腹腔后显露两侧卵巢，在子宫与卵巢之间用1号丝线结扎，切下卵巢，缝合切口，四周后选择其中10只大鼠处死并解剖第4腰椎、测量骨密度。未去卵巢大鼠第4腰椎的骨密度平均值(0.221±0.019) g/mm2、去卵巢大鼠第4腰椎的骨密度平均值(0.152±0.017) g/mm2，说明骨质疏松模型制备成功。

图2 三组间CPC强化椎体中成骨标志基因mRNA相对表达量的比较

采用Western blot检测CPC强化椎体中成骨标志基因ALP、OCN、OPN的蛋白相对表达量，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体中ALP、OCN、OPN的蛋白相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

图3 三组间CPC强化椎体中成骨标志基因蛋白相对表达量的比较

2.4 APN对CPC强化椎体中MAPK信号通路的影响 采用Western blot检测CPC强化椎体中MAPK信号通路分子磷酸化水平，1 mg/kg APN组、2 mg/kg APN组CPC强化椎体中p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2的蛋白相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

式中：Green、NIR(near infrared)、MIR(middle infrared)分别为绿波段、近红外波段、短波红外波段，在Landsat 8 OLI数据中，对应的波段数分别为第3、5和6波段像元的灰度值。

图4 三组间CPC强化椎体中p-p38MPAK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白相对表达量的比较

3 讨 论

骨质疏松性压缩性骨折会导致脊髓和神经根压迫，引起腰背疼痛、受压迫阶段神经功能障碍等临床表现，对患者的日常生活及身心健康均造成不利影响。经皮椎体成形术及后凸成形术能够快速减轻疼痛、增强受累椎体强度、防止椎体进一步塌陷。CPC是近些年用于经皮椎体成形术及后凸成形术的新型骨水泥，与传统的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥比较，CPC骨水泥的优势为可降解、生成的终产物羟基磷灰石与人体骨组织中的无机成分相似，因而生物相容性较好；此外，CPC固化过程中放热慢、升温小，不会对周围组织产生明显热损伤[5-6]。

虽然CPC骨水泥的临床应用较传统骨水泥具有一定优势，但该材料也存在一定不足，主要的不足是机械强度不足、CPC强化后的椎体抗压缩强度不足，这一不足也限制了CPC的临床应用[7-9]。因此，在CPC强化椎体后进行药物干预以增强椎体的强度能够弥补CPC的不足之处，进而增强CPC的临床应用价值[10-12]。CPC强化椎体局部成骨细胞介导的骨形成有助于增强骨骼的机械强度，促进成骨细胞分化是增强CPC强化椎体机械强度的重要思路[13]。APN是一种具有改善骨代谢作用的细胞因子，对干细胞的成骨分化具有促进作用[14-15]，对骨折愈合过程中的骨痂形成、骨微结构重建也有促进作用[4，16]。

国内王洋等[4]的动物实验使用1 mg/kg和2 mg/kg APN对胫骨骨折大鼠进行干预，本研究将1 mg/kg和2 mg/kg APN用于骨质疏松大鼠CPC强化椎体的干预，通过卵巢切除术得到骨质疏松大鼠，对第4腰椎进行CPC强化后1周开始给予APN干预。为了证实APN干预的价值，本研究使用双能X线检测骨密度、显微CT检测骨微结构等手段反映第4腰椎的骨质量，通过椎体压缩实验检测骨骼的生物力学强度，结果显示APN干预后CPC强化椎体的各项骨质量指标及生物力学指标均得到改善，表明APN显著增强骨质疏松大鼠椎体CPC强化后的骨质量和生物力学强度。

APN具有促进成骨分化的作用，而成骨分化又对增强CPC强化椎体的机械强度具有重要意义，基于此推测APN在CPC强化椎体中发挥的作用与促进成骨分化有关。ALP、OCN、OPN是经典的成骨标志基因，通过检测基因的mRNA及蛋白表达水平可知APN干预后CPC强化椎体中三种成骨标志基因的表达水平均明显增加，表明APN对骨质疏松大鼠椎体CPC强化后的成骨分化具有促进作用。目前研究认为APN的生物学作用与激活MAPK家族中的p38MPAK、JNK、ERK1/2有关[17-19]，本研究进一步检测上述三种信号分子的磷酸化水平，结果APN干预后CPC强化椎体中三种信号分子的磷酸化表达水平均明显增加。由此进一步明确APN对骨质疏松大鼠椎体CPC强化后成骨分化的促进作用，且这一作用与激活p38MPAK、JNK、ERK1/2通路有关。

综上所述，APN增强骨质疏松大鼠椎体CPC强化后的骨质量和生物力学强度，激活p38MPAK、JNK、ERK1/2通路是相关的分子机制，这为今后临床上使用CPC进行经皮椎体成形术及后凸成形术增强椎体强度提供了新的治疗思路。