食用菌发酵液对铜绿假单胞菌生长和生物膜形成的影响

陈 敏 梁馨云 文秋嘉 张 薇 郭文涛

抗生素的使用能够有效降低感染性疾病的致死率，然而长期使用抗生素会对病原菌形成选择压力，产生抗性突变，导致病原菌耐药性的产生和蔓延。耐药菌的存在限制了抗生素的使用，因此寻找新的抗菌药物迫在眉睫[1]。群体感应是细菌通过感知周围环境中的信号分子调控相关基因表达，调节自身以及周围细菌的生长，菌体间相互感应、交流，从而适应环境变化[2-3]。群体感应系统能够对生物膜的形成、毒力因子的表达等进行调控，由于群体感应不会直接影响微生物的生长，可避免产生生存压力与诱导耐药性，因此群体感应可以作为新型抗微生物药物的靶标[4]。

铜绿假单胞菌是常见致病菌，临床上常发现铜绿假单胞菌的耐药菌，给临床治疗造成很大困难[5-6]。食用菌多糖能够抑制细菌的生长，前期的研究发现香菇和鸡腿菇发酵液在一定程度上可以抑制白色念珠菌生物膜的形成[7]，本研究通过制备食用菌的液态发酵液，分析其对铜绿假单胞菌生长和生物膜形成的影响，为筛选新型抗感染药物寻找新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌和指示菌株供试食用菌香菇、茶树菇、金针菇、杏鲍菇、鸡腿菇、木耳为本实验室保存。铜绿假单胞菌PAO1 和紫色杆菌CV026 均为实验室保藏。

1.1.2 培养基食用菌液体发酵培养基：玉米粉20 g，麸皮40 g，蔗糖30 g，溶于1 000 ml 蒸馏水中，调pH 值为7.0。马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar,PDA）、沙氏琼脂（Sabouraud's agar, SDA）培养基、LB 培养基购于杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备YC-1102D 大容量恒温振荡器：上海程造仪器设备有限公司；LHP150L/250L 恒温恒湿培养箱：常州冠军仪器制造有限公司；生物安全柜：苏州长留净化科技有限公司；Multiskan SkyHigh全波长酶标仪：美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

1.2.1 食用菌液体发酵液的制备食用菌菌种接种于PDA 斜面，28 ℃培养6 d 得到斜面菌种，将菌种接种到100 ml 液体培养基中28 ℃，180 转/min 摇床培养 5 d 得到液体种子。按照7%的比例接种液体种子到100 ml 液体培养基中，28 ℃，180 转/min 摇床培养10 d，得到液体发酵液。

1.2.2 群体感应抑制剂的筛选报告菌株CV026 活化后转接到液体培养基，按体积分数1%接种到10 ml含有20 μg/ml 卡那霉素的LB 培养基，150 转/min，30 ℃ 培养16 h，取1 ml 菌液与含有20 μg/ml C6-HSL LB 半固体培养基混匀，倒平板。用打孔器打孔，将食用菌发酵液分别注入到小孔中，放置在28 ℃下恒温培养18 h，观察紫色素产生情况，判断食用菌发酵液是否具有群体感应抑制作用。

1.2.3 铜绿假单胞菌的培养配制2×LB 液体培养基，取1 ml 加入试管中，加入1 ml 食用菌发酵液，对照组设置为加蒸馏水，充分混匀。加入10 μl 吸光度A600 nm值为0.5的铜绿假单胞菌液，30 ℃，150转/min恒温振荡培养过夜。置于离心管中4 500 转/min 离心10 min，取上清液置于4 ℃保存备用。

1.2.4 食用菌液体发酵液对绿脓菌素产生量的影响取上清液2 ml，与1.5 ml 氯仿震荡混合，置于离心机中4 500 转/min 离心10 min，将氯仿提取液转移到新的离心管中，加入1.5 ml 2 mol/L HCl，充分混匀后静置片刻，取上层盐酸相中的液体，分光光度计检测在520 nm 处的吸光值，实验3 次取平均值。

1.2.5 牛奶平板法分析胞外蛋白酶活性量取2 g脱脂奶粉溶解到50 ml 蒸馏水中，同时称1.5 g 琼脂溶解到50 ml 蒸馏水中。两液分别高压灭菌后冷却至45～50 ℃，混合均匀后倒平板。使用0.6 cm的无菌打孔器在平板上打孔，取50 μl 上清液加入孔中，第2 天测量透明圈大小，比较不同组别水解圈的直径。

1.2.6 结晶紫染色法分析生物膜形成用去离子水轻轻地冲洗试管壁上的浮游菌。加入福尔马林固定5 min，倒出后加入0.1%的结晶紫染色30 min，倒出染液加入去离子水轻轻洗涤3 次。45 ℃烘箱干燥后，加入95%乙醇洗脱附着在生物膜上的染料，分光光度计检测有色溶液在650 nm 处的吸光值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，单因素方差分析比较不同组别间的差异，t检验用于两组间比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 群体感应抑制剂筛选

在琼脂平板上，香菇和鸡腿菇发酵液加样孔周围的紫色素含量下降，出现浑浊、不透明的抑菌圈；而茶树菇、金针菇、杏鲍菇、木耳发酵液孔周围紫色素变化不大，菌株能正常生长。

2.2 食用菌发酵液对绿脓菌素产生量的影响

检测发现香菇和鸡腿菇发酵液A520 值分别为（0.276±0.022）和（0.319±0.035），与对照组（0.477±0.041）相比显著降低（P＜0.05）。

2.3 食用菌发酵液对胞外蛋白酶活性的影响

细菌产生的蛋白酶能够分解平板中脱脂牛奶形成的透明圈，检测发现加入香菇和鸡腿菇发酵液后，透明圈的直径分别为（1.4±0.1）cm 和（1.3±0.2）cm，与对照组（2.1±0.2）cm 相比显著降低（P＜0.05）。

2.4 食用菌发酵液对生物膜形成的影响

经过培养后，能够在试管表面形成一层薄膜，且不会被无菌0.9%氯化钠注射液冲洗掉，香菇和鸡腿菇发酵液均可在一定程度上抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，A650 值分别为（0.278±0.022）和（0.316±0.032），与对照组（0.475±0.044）相比显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

群体感应系统的存在提高了细菌的种群适应性，为细菌的耐药性研究提供了新的角度。针对群体感应系统寻找群体感应抑制剂已成为抗菌药物研究和耐药性研究热点领域[8-9]。食用菌作为天然可食用的大型真菌，研究发现提取物和发酵液除了具有药用价值外，还具有一定的抑菌能力。食用菌中的多糖成分能够对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等多种微生物产生抑制作用[10-11]。罗青等[12]的研究发现灵芝和猴头菌丝体发酵液能够对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌产生抑制作用，其中猴头的抑菌效果更优。董蕾等[13]的研究发现杏鲍菇和蛹虫草的发酵液、菌糠提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制效果。本研究采用紫色杆菌CV026 为研究菌株，对不同食用菌发酵液进行筛选，发现香菇和鸡腿菇发酵液加样孔周围紫色素含量降低，这两种食用菌可显著抑制紫色杆菌CV026 紫色素的产生，具有作为群体感应抑制剂的潜能。

铜绿假单胞菌作为感染的常见致病菌，近年来在临床中发现其耐药性越来越严重。该菌的致病性受到群体感应系统的调控，群体感应系统能够对绿脓菌素、胞外蛋白酶、生物膜等细菌生物学特征产生影响，增强了细菌的致病性[14]。生物膜是细菌分泌多种产物组成的复合物，依附于细菌表面。有生物膜的细菌环境适应能力提高，增加了在附着面的黏附能力，抑制部分药物进入细菌体内，提高了细菌的耐药性，逃避宿主的免疫防护[15]。本研究通过检测香菇和鸡腿菇发酵液对铜绿假单胞菌绿脓菌素、胞外蛋白酶、生物膜的影响，发现这两种发酵液可以抑制绿脓菌素、胞外蛋白酶和生物膜的的产生。

食用菌发酵液纯天然无公害，对人体的安全性较高，其抑菌作用的深入研究将有可能在食品和医疗上得到应用。本研究发现香菇、鸡腿菇发酵液在控制铜绿假单胞菌感染中具有进一步的研究价值。通过对其作用成分的深入研究，将具有开发利用的巨大潜力。