一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

熊苏玥，李家鹏，李金春，韦忆萱，许随根，刘睿茜，陈 曦，王守伟，曲 超，乔晓玲

（中国肉类食品综合研究中心，北京食品科学研究院，国家肉类加工工程技术研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

肉及肉制品的“掺假”是食品加工、流通和餐饮中存在的重要问题[1-2]，价格差异带来的经济利益驱使一些不法商贩和企业在牛肉等高价肉制品中掺入一些低廉肉种，甚至使用一些经过违规添加剂处理后的植物源性添加物冒充高价肉，严重侵害消费者权益和健康[3]。因此需要建立对市售肉制品中牛源性成分精准定量的检测方法，以判定掺假的类型及严重程度，解决定性检测中无法区分污染和恶意掺假的假阳性问题。

国内外关于动物源性成分检测除了传统理化检测技术，主要还有基于蛋白质的检测技术以及DNA的分子生物学检测技术[4]，其中分子生物学技术以其检测灵敏度高、重复性好、准确度高等优势，适用于经各种加工条件处理后成分复杂的肉制品中肉成分的检测[5-6]。目前已有大量关于基于普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的定性方法和基于real-time PCR的相对定量检测方法的研究报道[7-9]，但相对定量方法需要基于标准曲线才能实现定量，同时real-time PCR的标准曲线需依赖于Ct值，引物设计或扩增条件的细微差异都可能影响PCR扩增效率，进而导致定量的不准确[10]。

微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技术是近年来发展起来的定量分析技术，通过将PCR体系分配到约2万 个独立的反应液滴中并且发生扩增反应，统计每个独立微滴中的阳性信号结合泊松分布原理，对模板中核酸的拷贝数进行绝对定量[11]，避免了样品差异性及扩增效率变化而导致的定量结果不准确[12]。目前ddPCR技术已广泛应用于转基因检测、致病菌微生物检测、拷贝数变异分析以及疾病诊断等领域[13-16]。近年来，随着ddPCR及其他分子生物学技术的不断发展和日趋完善，陆续有研究将ddPCR技术应用于肉类食品成分定量分析，李伟琦等[17]比较了ddPCR与芯片式PCR在火鸡源性成分定量检测中的差异，发现两种检测方法对5%及以上含量样品的检测数据具有一定的稳定性和可重复性。刘立兵等[18]以提取的样品DNA浓度为中间值，建立其与DNA拷贝数和目标肉样质量之间的两组标准曲线，从而实现对鸡、猪、牛源性成分的精准定量，相比于Koppel等[19]开发的realtime PCR定量检测方法中对鸡肉及猪肉含量定量方法相对标准偏差更小；通过直接建立拷贝数与质量分数之间的关系，Ren Junan等[20]实现了羊肉中掺杂猪肉或鸡肉成分的ddPCR精准定量检测方法，发现该方法比定量PCR的检测结果更接近真实值，相对标准偏差更低。但由于市场上肉制品中混合成分多样，掺假肉源种类众多，除常见的低价禽畜肉类外，更有甚者会掺入一些貉子肉等不能食用的动物肉以次充好，或者选择植物源性添加物增加质量。因此，固定的检测某类掺假物质会降低检测掺假效率，加大工作量，有待开发可同步检测多种肉类的检测方法。

本研究建立双重ddPCR体系，同时扩增牛源性成分与动物源性成分，除了对牛源性成分进行定量检测，还可以通过ddPCR双通道拷贝数比值，判断是否存在牛肉源性之外动物源性成分参与通用引物的扩增，以期为打击肉类产品掺假售假等违法违规行为提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、狗肉、狐狸肉、貉子肉、鹿肉、驴肉、胖头鱼肉、马肉 市购；猫血、鼠血在北京某宠物医院采集；牛肉丸、牛排等牛肉制品北京某超市。

Droplet Generation Oil for probes 美国Bio-Rad公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）美国Bio-Rad公司；Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒 上海凯杰有限公司；SYBR Green Enzyme Premix 罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

ddPCR系统（QX200微滴生成仪、C1000 PCR仪、QX200微滴读取分析仪） 美国Bio-Rad公司；5415R高速冷冻离心机 德国Eppendorff公司；OMNI Prep多样品剪切均质匀浆机 美国OMINI公司；Nanodrop2000微量核酸蛋白检测仪 Thermal中国有限公司；LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针的设计

从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）下载目标物种牛（NC_037352.1）及其他动物的单拷贝基因序列β-actin，将目标物种与其他动物源性物种基因序列进行比对（MEGA 6.0），选择差异序列用于设计特异性引物和探针，保守区域用于通用引物和探针的设计。用HEX荧光染料基团标记牛源性探针的5’端，FAM荧光染料基团标记动物源性探针的5’端，非荧光淬灭基团均采用BHQ标记，引物和探针均由Invitrogen公司合成，详细序列见表1。

表1 用于多重ddPCR的引物Table 1 Primer sequences used for multiplex PCR

1.3.2 样品前处理

参考Noh等[21]的方法，取样品的肌肉组织于组织匀浆机中绞碎后80 ℃烘干72 h，再用粉碎机研磨成粉，匀质过程中不同肉类分开处理，防止样品间交叉污染。

1.3.3 DNA提取

参考Santella[22]采用CTAB法提取基因组DNA，分别准确称取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg的牛肉粉末作为实验的标准品，加入800 μL组织裂解液和20 μL蛋白酶K，涡旋振荡混匀，56 ℃水浴1 h后12 000 r/min离心5 min；吸取上清液600 μL，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24∶1，V/V）溶液，混匀后12 000 r/min离心5 min；吸取上清液400 μL，加入80%体积的异丙醇，混匀后常温静置沉淀30 min，12 000 r/min离心5 min。弃掉上清液，加入500 μL的70%乙醇溶液洗涤沉淀2 次，12 000 r/min离心5 min；弃去上清液，室温下自然干燥后加入TE缓冲液100 μL溶解DNA。

1.3.4 引物和探针的设计与特异性评价

利用鼠、牛、羊、猪、马、鹿、狐狸、猫、狗、鱼、鸡、鸭、貉子和驴共14 个物种所提取的基因组DNA，采用real-time PCR技术进行相应引物、探针的特异性和通用性验证。所用的10 μL的real-time PCR体系包含：LightCycler 480 Probe Master 5 μL，DNA 模板2 μL（质量浓度为5 ng/μL），上下游引物（10 nmol/μL）0.6 μL，探针（10 nmol/μL）0.3 μL，ddH2O 1.5 μL。realtime PCR条件： 95 ℃预变性5 min， 95 ℃变性15 s，64 ℃退火、延伸45 s，40 个循环，同时连续检测荧光强度。

1.3.5 ddPCR退火温度优化

如表2所示，两种引物和探针的终浓度均为900 nmol/L和200 nmol/L。将加入DNA模板后的反应液转移到微滴生成卡中，加入70 μL液滴生成油，生成微滴。将生成的40 μL微滴转移至96 孔板中，封膜后放入C1000 PCR仪中进行扩增。为考察扩增退火温度对读取拷贝数定量结果的影响，采用不同的退火温度以优化PCR，以20 ng/μL牛DNA为模板，PCR条件： 95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，于不同温度60、61、62、63、64 ℃退火、延伸1 min，共40 个循环；98 ℃、10 min，升降温速率为2 ℃/s。

表2 双重ddPCR体系组分及配比（总体积20 μL）Table 2 Composition of ddPCR system (total volume of 20 μL)

1.3.6 牛肉质量与拷贝数换算公式的确定

1.3.6.1 牛肉质量与DNA质量浓度的线性关系

分别称量5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg共10 个质量梯度的牛肉样品提取DNA，每个梯度重复3 次。提取完成后采用NanoDrop2000核酸定量测定仪测定DNA质量浓度与纯度，以3 个平行的DNA质量浓度平均值（ng/μL）为纵坐标，使用Excel拟合标准曲线，得到牛肉质量-DNA质量浓度的线性关系式。

1.3.6.2 DNA质量浓度与拷贝数的线性关系

将提取的牛DNA按比例稀释后，用NanoDrop2000核酸定量测定仪测定稀释后的DNA质量浓度与纯度，最终得到5、10、24、48、73、96、145、200、260、300 ng/μL 10 个不同质量浓度梯度的牛DNA。按照优化后的扩增条件进行扩增，使用微滴分析仪和QuantaSoft V1.3.2软件对ddPCR扩增产物进行检测和分析。每个体系的有效微滴数应高于12 000 个微滴，以满足泊松统计的需求，记录有效的拷贝数浓度（C），每个梯度3 个重复，分别计算其平均值，使用Excel拟合DNA浓度与拷贝数浓度之间的标准曲线。同时通过双通道拷贝数比值计算样品中牛源性成分在动物源性成分中的拷贝数相对含量，计算公式如下：

1.3.7 ddPCR的抗干扰及适用性实验

1.3.7.1 定量方法对混合牛肉样品的抗干扰验证

为验证所建ddPCR方法对外源性物种的抗干扰性，以总质量为50 mg，分别称量不同质量的牛肉与猪肉制成9 个质量分数（10%～90%）的混合样品，同时选取羊肉、驴肉、马肉、貉子、狐狸肉、鸡肉和鸭肉7种其他肉样与牛肉按照质量比2∶3制成两两混合样品。提取混合肉样DNA后进行双重ddPCR检测。分别对样品中的牛源性成分进行定量检测，并计算双通道拷贝数相对含量。

1.3.7.2 定量方法对不同牛肉样品的适用性验证

为验证所建ddPCR方法对不同鲜切牛肉产品的适用性，分别从某市场中购买牛五花趾、牛匙柄、黄牛腿肉、黑牛腱子、黑牛吊龙等10 件不同部位、不同品种的牛肉鲜切产品。在线性范围内，分别称取每个产品10、25、40 mg 3 个不同质量梯度，对产品中的牛源性成分进行定量检测，并计算双通道拷贝数相对含量。

1.3.8 市售样品的检测

分别从某市场中购买牛肉及猪肉（牛肉丸、牛排、猪肉丸等）等15种不同类型的成分复杂的肉制品，提取DNA后利用建立的ddPCR方法对肉制品中牛源性成分质量进行检测，以验证所建立的ddPCR实际检测效果。

2 结果与分析

2.1 引物和探针的设计与验证

采用14种物种的DNA验证牛源性引物的特异性及用动物源性引物的通用性，扩增结果如表3所示，14种物种中仅有牛DNA为模板时，可在牛源性特异引物扩增时出现扩增曲线，其他物种均无荧光信号值的增加。证明所设计的引物对食品中常见的肉种有良好的特异性，不会扩增出食品中常见的非牛动物源性成分，以免干扰定量的精准性。同时，动物源性通用引物扩增时，仅有空白对照组未出现扩增曲线，说明该通用性引物能够用于常见动物源性成分检测。

表3 real-time PCR特异性引物检测结果Table 3 Results of specific primer test by real-time PCR

2.2 ddPCR扩增条件优化

当退火温度为60、61、62、63、64 ℃时，检测结果如图1所示，蓝色散点为FAM通道1中通用性引物扩增成功的目标微滴，拷贝数浓度为（104±3）copies/μL，灰色散点为未发生扩增或发生非特异性扩增，荧光强度低相对较低的非目标微滴，不参与计数；绿色散点为HEX通道2中特异性引物成功扩增的目标微滴，拷贝数浓度为（106±4）copies/μL。所有退火温度均能有效区分阴性和阳性微滴点，但在FAM通道1中，随着扩增温度的下降，动物源性通用引物出现的非特异性扩增的液滴数量上升。在模板浓度更高的情况下，可能会干扰目标基因的正常读数，因此选择64 ℃作为该牛源性-动物源性成分双重ddPCR体系的退火温度。

图1 不同退火温度下双重ddPCR双通道中拷贝数1D散点图Fig. 1 1D scatter plots of copy number in two channels of ddPCR system at different annealing temperatures

2.3 肉样质量与拷贝数计算公式

2.3.1 目标肉样质量与DNA质量浓度的关系

牛肉质量在5～50 mg范围内，牛肉质量与提取的DNA质量浓度有显著的线性关系：y1=6.926 1x1-17.167；R2=0.998 1，其中，x1代表牛肉的质量（mg），y1代表所测得的DNA质量浓度（ng/μL）。

2.3.2 DNA总量与DNA拷贝数的关系

在Beta-actin单拷贝基因靶标体系下，ddPCR检测过程中每个样品的微滴生成均在12 000以上，满足了泊松分布计算的要求，且DNA总量与其所生成的DNA拷贝数之间有显著的线性关系：y2=4.389 2x2+3.392；R2=0.998 5。其中，x2代表所加模板DNA总量（ng），y2代表每微升的DNA特异性扩增拷贝数（copies/μL）。

同时，在以不同质量浓度牛肉DNA为模板扩增时，特异性引物扩增的拷贝数与通用引物扩增的拷贝数比值为1.00±0.04，表明在检测样品中，牛肉在动物源性成分中的相对含量为小于或等于（100±4）%，该误差范围包括机器微滴读取与泊松分布计算误差（＜5%），符合样品含有100%牛肉的样品性质。

2.3.3 肉样质量与拷贝数换算公式的确定结果

根据目标肉样的质量与所提取DNA质量浓度之间的线性关系及DNA质量浓度与所测定DNA特异性扩增拷贝数之间的线性关系，选择DNA质量浓度作为中间值，推导出目标肉样的质量与特异性扩增拷贝数之间的关系式M牛=0.033C牛+2.37，因此可通过测定DNA特异性扩增拷贝数，计算检测样品中牛源性成分的质量。其中，M牛为牛源性成分的质量（mg），C牛为每微升的DNA特异性扩增拷贝数（copies/μL）。

2.4 ddPCR抗干扰实验和适用性验证

2.4.1 ddPCR的抗干扰实验结果

在牛肉与其他肉类制成两两混合样品中，牛肉定量检测数值与实际质量基本一致（表4），且随着牛肉的实际质量由5 mg上升至45 mg，定量检测值准确性逐渐提高，相对标准偏差由12.68%降低为1.33%，说明该方法对牛肉源性成分的定值基本准确。而得到的拷贝数相对含量与牛肉实际相对含量存在明显的偏差。由牛、猪肉两两混合样品的检测结果可得，在牛肉实际相对含量为10%时，牛肉检测相对含量仅为2.52%，随着牛肉含量的上升，拷贝数相对含量与实际含量相差逐渐缩小。

这可能是由于相同质量下，猪肉中提取到的可参与通用性引物扩增的核酸分子含量高于牛肉，在大量猪肉成分存在时，通用引物的拷贝数相对提升较多，导致拷贝数相对含量明显低于理论值。相反的情况则出现在存在鸡、鸭源性成分时，这两种非牛源性成分在通用性引物扩增时得到的拷贝数较低，使牛肉相对含量高于理论值。这表明通过双通道扩增拷贝数比值计算得到的相对含量是否小于（100±4）%仅可以判断样品中是否存在非牛源性成分，但无法对其他动物源性成分进行定性及定量检测。

表4 已知质量的混合肉样的ddPCR定量分析Table 4 Results of ddPCR for known mixed meat samples

2.4.2 ddPCR的适用性验证

采用建立的双重ddPCR方法对不同品种、不同部位的牛肉进行10、25、40 mg 3 个不同质量梯度的定量鉴定。如表5所示，10 个不同部位的定量结果在10、25、40 mg 3 个不同质量梯度时，平均值分别为9.75、26.30、36.16 mg，相对标准偏差分别为-2.52%、5.20%、-9.60%，可见不同牛肉部位的检测结果相对偏差随着质量的增加而升高。这可能是由于不同部位或品种的样品，相同质量下的细胞含量有所差异，不同组织成分在制成干粉后DNA提取效率也不尽相同，导致扩增后的定量结果产生了一定的偏差。

所有样品通过扩增双通道中特异性引物与通用性引物的扩增拷贝数之比，得到的拷贝数相对含量为92.59%～99.01%，与牛肉实际相对含量100%基本相符，部分略低于95%的样品如牛匙柄、黑牛里脊等鲜切产品，可能是由于超市加工环节或者样品流通中的无意沾染造成的误差。

表5 不同部位、不同品种牛肉样品的ddPCR定量分析Table 5 Results of ddPCR for beef samples from different body parts and species

2.5 市售肉制品中牛肉成分的检测结果

利用本研究建立的双重ddPCR方法，对于成分复杂、肉种多样的市售肉及肉制品进行定量鉴定（表6）。结果表明，在明确标注牛肉含量的第1～4号产品中，检测结果均基本符合产品标注；而部分市售肉制品存在部分含量不足及掺假现象，如第6、10号产品中，牛肉定量检测的质量分数为3.00%与4.30%，说明该类样品中的牛肉含量过低，同时检测拷贝数相对含量为55.56%与98.04%，分别符合6号产品中含有其他动物源性成分以及10号产品中仅牛肉的标注；对7号样品鲜牛肉馅的检测发现，牛肉定量检测的质量分数为77.55%，拷贝数相对含量为81.97%，排除超市可能出现混装柜台或者共用绞肉机等器具造成的误差，该牛肉馅样品仍可能存在一定的掺假情况。13～15号样品为猪肉丸，该类样品未检测到牛源性成分，说明所建立的ddPCR体系在复杂的食物基质中检测时可保持良好特异性。

表6 市售样品的ddPCR定量分析Table 6 Results of ddPCR for commercial beef samples

3 讨 论

目前，食品安全和食品原料成分掺假等问题已经引起越来越多的关注[23]，real-time PCR作为现在监管部门对肉制品鉴别的常用技术手段，已渐渐不能满足目前市场出现的各类复杂掺假现象的检测和监管。大量研究表明ddPCR相比于real-time PCR，尤其在在检测低含量的核酸成分时，具有更高的准确度和灵敏度[24-26]。

市售肉制品存在原料肉种类多样，添加剂成分复杂等情况，一些肉制品多含有凝胶等添加剂，使得部分ddPCR检测方法检测准确性受限[27]，刘立兵等[28]建立的鸭源性成分ddPCR定量检测方法中，发现在选取鸭皮肤、脂肪或内脏等部分，而非鸭红肉部分作为样品进行检测时，会导致误差升高。同时肉制品在生产加工过程中通常会受高温、高压等条件影响，目的DNA可能会出现含量降低、高度片段化等现象，增加检测难度[29]。本研究建立的检测体系主要着眼于市售肉及肉制品，通过检验市场上多种不同类型的肉制品进行取样实验，结果显示无论在肉样两两混合还是复杂的食品基质中，对牛源性成分的检测都与实际质量基本一致，也发现了市场上的确存在部分掺假产品。

目前已有研究主要针对市场某些常见肉类掺假模式[30-31]，苗丽等[32]建立了一种基于ddPCR技术的牛肉与猪肉的检测方法，可针对性的对牛肉中掺入的猪肉进行定量分析。刘立兵等[33]通过ddPCR技术分别对牛GH基因和猪PRNP基因的拷贝数进行检测，采用固定比值法准确检测到样品中猪肉源性成分的质量分数。René等[34]通过建立双重ddPCR对不同的荧光信号进行读取，每个双重ddPCR体系可实现对羊、马、鸡等多种动物源性成分中的两个物种的准确定量。然而，这类方法仅适用于2种肉类混合的样本，而市售肉制品中常含有多种肉源性成分。为增加检测肉品种类，赵新等[35]引入内参基因，通过进行羊种属特异性和动物源性通用性的拷贝数浓度两次检测，在一定掺假范围内，可准确定量掺有鸡、鸭、猪等多种鲜冻畜、禽肉产品中羊源性成分质量分数。但目前尚无包含通用动物源性成分的双重ddPCR检测方法，本研究所建立的基于ddPCR检测技术的双通道检测技术，利用牛特异性扩增与动物源性通用性扩增的拷贝数之比，扩大了对掺假肉类种类的检测范围，可判断是否存在非牛源性的其他动物成分。

另一方面，在检测牛肉与不同物种混合样品时，发现不同物种在相同的样品质量下，肌肉细胞数乃至DNA提取效率不尽相同[36]，导致动物源性成分通用引物在扩增各物种DNA时，拷贝数与样品质量不成比例，这与杨华等[37]建立的检测牛源性成分的双重ddPCR结果一致，在样品中掺入鸡肉、鸭肉和猪肉不同肉源性成分后，其DNA拷贝数之比难以计算出其准确的组分质量比。在相同物种的不同部位，也存在拷贝数浓度差异较大的情况，纪艺等[38]通过研究鸭的不同品种及不同部位生鲜组织的拷贝数变异系数，发现检测核DNA时，鸭心或鸭血相较于肌肉组织较多的鸭腿部分，定量值的变异系数由4.1%升高至21%以上。因此，目前还不能通过对样品中不同肉源性成分的DNA拷贝数比计算出其组分的质量比，存在无法对掺假肉种类定性、定量检测的不足之处。有待通过挖掘各物种间通用性引物扩增差异进一步改善，或建立扩增不同荧光值的靶标[39]区分不同物种ddPCR方法。