超分子双波长共振光散射法测定半胱氨酸含量

刘 毅，袁 莉，袁嘉怡，储 文，马卫兴,2,3,*

（1.江苏海洋大学药学院，江苏 连云港 222005；2.江苏海洋大学生物医药产业学院，江苏 连云港 222005；3.江苏省海洋药物筛选重点实验室，江苏 连云港 222005）

L-半胱氨酸是一种含有巯基的天然氨基酸，不仅在人体新陈代谢、蛋白折叠、酶促反应等生理过程中扮演着重要角色[1-2]，其水平异常还可能与疾病相关，例如：生长缓慢、脱发、水肿、肝脏损伤、肌肉松弛以及皮肤病变等[3-4]。同时，半胱氨酸可作为风湿性关节炎、帕金森病、阿尔茨海默症、妊娠并发症以及乳腺癌等癌症的生物标志物[5-7]。半胱氨酸在食品、医药、化妆品行业也有着广泛应用，例如食品添加剂[8]、肝脏药、解毒药[9]以及美白产品[10]等。

因此，建立省时高效的方法用于半胱氨酸的定量测定具有重要意义。目前，检测半胱氨酸的分析方法主要有分光光度法[11-12]、荧光分析法[13-14]、电化学法[15-16]、高效液相色谱法[17-18]、滴定法[19-20]等，这些方法多数需要精密仪器，且操作复杂、成本较高。共振光散射技术是一种在荧光分光光度计上进行测定的分析技术，具有简便、灵敏、快速、成本低廉等优点，广泛应用于食品、药品中某些成分的定量检测[21-23]。

有研究表明亚硫酸根在碱性条件下能够与孔雀石绿发生加成反应[24-25]，因此，半胱氨酸上的巯基也可与孔雀石绿发生加成反应。通过探索半胱氨酸-孔雀石绿体系的最佳反应条件，建立孔雀石绿单波长、双波长共振光散射光谱法检测半胱氨酸的新方法，并应用于保健食品L-半胱氨酸护肝胶囊和酱油中半胱氨酸的定量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-半胱氨酸护肝胶囊 湖北舒邦药业有限公司；酱油为市售海天和李锦记酱油。

L-半胱氨酸（纯度≥98.5%）、硼砂、氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司；孔雀石绿 阿拉丁试剂（上海）有限公司。以上试剂均为分析纯，超纯水为实验室超纯水机制备。

1.2 仪器与设备

F-7000型荧光分光光度计 日本日立公司；BS210S分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；pHS-3C精密酸度计 上海虹益仪器仪表公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

半胱氨酸标准溶液：用超纯水将L-半胱氨酸配成0.50 g/L的储备液，放入冰箱保存。使用时用超纯水稀释100 倍配制成质量浓度为5.00 mg/L的标准溶液。

孔雀石绿溶液：称取18.2 mg孔雀石绿溶于500 mL超纯水中，制备浓度为1.00×10-4mol/L的孔雀石绿溶液。

硼砂-氢氧化钠缓冲液：用0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氢氧化钠溶液混合配制成pH 9.3～10.1的硼砂-氢氧化钠缓冲液，使用酸度计测定其pH值。

待测溶液：准确加入适量5.00 mg/L半胱氨酸标准溶液、适量1.00×10-4mol/L孔雀石绿溶液、0.5 mL特定pH值的缓冲溶液于10 mL比色管中，用超纯水定容并摇匀，得到待测溶液，反应一定时间后用于共振光散射分析。

空白溶液：不加入半胱氨酸标准溶液，其余制备条件与待测溶液相同。

1.3.2 共振光散射分析

取适量溶液于1 cm石英比色皿中，调节仪器激发波长与发射波长相等，狭缝宽度为5 nm，在200～800 nm内扫描测定待测溶液和空白溶液得到共振光散射光谱，得到最佳波长下待测溶液的共振光散射强度（I）及空白溶液散射强度（I0），计算共振光散射强度差值（ΔI）：ΔI＝I-I0。

1.3.3 标准曲线与检出限测定

取7 支10 mL比色管，分别加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL质量浓度为5.00 mg/L的半胱氨酸标准溶液，再向每支加入2.50 mL浓度为1.00×10-4mol/L的孔雀石绿溶液和0.50 mL pH 9.7的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液，用超纯水定容并摇匀。反应20 min后，取适量溶液进行共振光散射分析。分别计算285、338 nm波长处以及两波长叠加时的ΔI。以半胱氨酸质量浓度（c）为横坐标，ΔI为纵坐标，绘制出不同波长下的标准曲线：ΔI285-c、ΔI338-c及双波长叠加ΔI285+338-c，

1.3.4 干扰实验

按照上述方法，最佳条件下在体系中加入测定时可能存在的共存物质（其他氨基酸以及半胱氨酸胶囊中的其他物质）考察共存物质是否会干扰双波长法的测定结果。

1.3.5 回收实验

按照上述方法，最佳条件下用双波长叠加法测定待测溶液和空白溶液的共振光散射强度，重复测定10 次，以双波长回归方程分析处理数据。

1.3.6 实际样品测定

1.3.6.1 护肝胶囊半胱氨酸含量测定

随机抽取市售的舒邦L-半胱氨酸护肝胶囊5 粒（半胱氨酸标示量为72 mg/粒），将胶囊的内容物取出，混合均匀后准确称取0.138 9 g（相当于半胱氨酸5 mg）倒入250 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。过滤后弃去适量初滤液，得到续滤液。分别移取25.0 mL续滤液至100 mL容量瓶中，用水定容并摇匀，得到3 组待测样品溶液。以灵敏度较高的双波长叠加法测定样品溶液中半胱氨酸含量，各平行测定6 次。将本方法测定结果与Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]进行比较。

1.3.6.2 酱油中半胱氨酸含量测定

选择超市购买的海天和李锦记两种不同品牌的酱油，级别均为一级（氨基酸态氮≥0.700 g/100 mL）。分别取5.00 mL于50 mL棕色容量瓶中，用超纯水定容并摇匀，得到酱油样品溶液。向2 支10 mL比色管中，分别加入1.00 mL海天和李锦记酱油样品溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L的孔雀石绿溶液、0.50 mL pH 9.7硼砂-氢氧化钠缓冲溶液，用超纯水定容并摇匀。反应20 min后进行共振光散射光谱分析。以灵敏度较高的双波长叠加法测定样品溶液中半胱氨酸含量，各平行测定6 次。将本方法测定结果与Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]进行比较。

1.4 数据处理

采用最小二乘法建立回归方程，使用Excel处理数据，使用Origin 9.1、Chemdraw 20.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 共振光散射光谱分析

待测溶液为1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸标准溶液、2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石绿溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液；空白溶液为2.50 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石绿溶液、0.50 mL pH 9.7的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液；反应20 min后测定待测溶液及空白溶液的共振光散射光谱。如图1所示，在285、338 nm波长处有两个较强烈的共振光散射峰，表明孔雀石绿在硼砂-氢氧化钠缓冲液中自身形成超分子聚合物，产生了共振光散射；加入半胱氨酸后，共振光散射更加强烈，这是因为半胱氨酸与孔雀石绿超分子聚合物发生加成反应，形成了体积更大的超分子聚合物。因此，可选择285 nm或者338 nm单波长法测定半胱氨酸含量，也可将两个波长处的共振光散射强度叠加使用双波长法测定半胱氨酸含量。

图1 待测溶液及空白溶液的共振光散射光谱Fig. 1 Resonance light scattering spectra of the sample and blank solutions

2.2 半胱氨酸-孔雀石绿体系的反应条件优化分析

2.2.1 硼砂-氢氧化钠缓冲溶液pH值及添加体积对共振光散射强度的影响

半胱氨酸-孔雀石绿体系为1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸标准溶液和2.00 mL 1.00×10-4mol/L孔雀石绿溶液；缓冲溶液为0.5 mL不同pH值的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液；反应时间为20 min。如图2所示，在pH 9.7时，体系的ΔI最大，增加或者减小pH值，ΔI均减小。在pH 9.7条件下，不断改变硼砂-氢氧化钠缓冲溶液的体积，结果如图3所示，缓冲溶液的体积对体系的ΔI影响不大，曲线较平稳，当缓冲液体积为0.40～0.60 mL时，ΔI最大且稳定。因此，取中间值，选择0.50 mL pH 9.7的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液。

图2 不同硼砂-氢氧化钠缓冲溶液pH值下体系的ΔIFig. 2 ΔI of the system a a function of pH of borax-sodium hydroxide buffer solution

图3 不同硼砂-氢氧化钠缓冲添加溶液体积下体系的ΔIFig. 3 ΔI of the system as a function of volume of borax-sodium hydroxide buffer solution

2.2.2 孔雀石绿溶液添加体积对共振光散射强度的影响

在最优缓冲溶液条件下，使用1.00 mL 5.00 mg/L半胱氨酸标准溶液和不同体积（0.50～3.50 mL）1.00×10-4mol/L孔雀石绿溶液；反应时间为20 min。如图4所示，ΔI随着孔雀石绿体积增加而增大，在2.50 mL时体系的ΔI最大，继续增加体积ΔI降低。因此，孔雀石绿溶液的最佳添加体积为2.50 mL。

图4 不同孔雀石绿溶液添加体积下体系的ΔIFig. 4 ΔI of the system as a function of volume of malachite green solution

2.2.3 反应时间对共振光散射强度的影响

在室温下，在最佳条件下，考察半胱氨酸与孔雀石绿的反应时间对体系共振光散射强度的影响。结果表明，随着反应时间的延长，ΔI不断增大，20 min时达到最大并在1 h内基本不变，说明半胱氨酸-孔雀石绿体系在20 min内反应完全，具有较好的稳定性。因此，选择半胱氨酸-孔雀石绿体系的最佳反应时间为20 min。

2.2.4 试剂加入顺序对共振光散射强度的影响

在最佳条件下，对半胱氨酸-孔雀石绿-缓冲溶液、半胱氨酸-缓冲溶液-孔雀石绿、孔雀石绿-缓冲溶液-半胱氨酸、孔雀石绿-半胱氨酸液-缓冲溶液、缓冲溶液-半胱氨酸-孔雀石绿、缓冲溶液-孔雀石绿-半胱氨酸6种加入顺序进行比较。结果表明：试剂的加入顺序对I和ΔI影响不大。实验选择半胱氨酸-孔雀石绿-缓冲溶液顺序。

2.3 标准曲线与检出限分析

本方法的线性范围为0.10～0.60 mg/L，单波长和双波长法对应的线性回归方程、相关系数和检出限如表1所示，双波长法的检出限更低，为0.003 23 mg/L。

表1 标准曲线相关参数Table 1 Standard curves, correlation coefficients and limits of detection of single-wavelength and dual-wavelength resonance light scattering spectroscopy

2.4 共存物质的干扰分析

由表2可知，所测共存物质均对0.50 mg/L半胱氨酸不造成干扰，相对误差在±5%以内。因此，本方法具有良好的选择性。

表2 干扰实验结果Table 2 Results of interference test

2.5 精密度分析

如表3所示，方法的回收率在97.3%～102.0%之间，平均值为99.4%，相对标准偏差为0.50%。因此，本方法具有良好的精密度。

表3 回收实验结果Table 3 Results of recovery test

2.6 实际样品分析

2.6.1 护肝胶囊中半胱氨酸含量分析

如表4所示，本方法测定结果与Ni2+分光光度法[11]和碘滴定法[26]测定所得结果基本一致，且3 组样品的相对标准偏差均小于3%，符合定量分析的要求。

表4 护肝胶囊中半胱氨酸的测定结果（n＝6）Table 4 Results of determination of cysteine in hepatoprotective capsules (n = 6)

2.6.2 酱油中半胱氨酸含量分析

由表5可知，本方法测定结果与分光光度法[11]和碘滴定法[26]测定所得结果基本一致；海天酱油、李锦记酱油中半胱氨酸的质量浓度分别为0.288 mg/L和0.257 mg/L，且相对标准偏差均在3%以内，符合定量分析的要求。

表5 酱油样品中半胱氨酸的测定结果（n＝6）Table 5 Results of determination of cysteine in soy sauce (n = 6)

3 讨 论

图5 半胱氨酸-孔雀石绿加成反应机理Fig. 5 Mechanism of cysteine-malachite green addition reaction

图6 超分子结构式Fig. 6 Supramolecular structural formula

最优实验条件下，半胱氨酸与孔雀石绿物质的量比为1∶6。文献[24-25]报道了亚硫酸根在碱性条件下与三苯甲烷类染料孔雀石绿的加成反应，是因为亚硫酸根上硫原子具有一对孤对电子才能与孔雀石绿发生加成反应。同样，半胱氨酸分子上巯基硫原子具有两对孤对电子，按照类比思维，半胱氨酸的巯基硫原子同样可以与孔雀石绿发生加成反应，生成具有3 个独立苯环的硫醚衍生物1，反应机理见图5。在硼砂-氢氧化钠缓冲介质中，3 个孔雀石绿分子与1 个硼酸分子上的3 个羟基分别通过分子间氢键形成超分子2（图6），引起共振光散射现象，体系在波长285 nm和338 nm处形成两个较强烈的共振光散射峰。当体系中加入半胱氨酸后，半胱氨酸首先与孔雀石绿发生加成反应形成加成反应产物1；加成产物1上的两个叔胺氮原子和1 个伯氨氮原子分别与3 个孔雀石绿阳离子形成n→π型电荷转移配合物，加成产物1上的1 个孤立苯环与1 个孔雀石绿阳离子形成π→π型电荷转移配合物，加成产物1上的羧酸根阴离子与1 个孔雀石绿阳离子通过静电引力作用形成离子缔合物，这样1 个半胱氨酸与6 个孔雀石绿阳离子反应形成体积更大的超分子3，导致体系的共振光散射强度更强；且ΔI与半胱氨酸质量浓度之间呈线性关系，据此建立孔雀石绿共振光散射光谱法测定半胱氨酸含量。

4 结 论

依据半胱氨酸与孔雀石绿在碱性条件下发生加成反应、加成产物与孔雀石绿进一步的离子缔合反应和电荷转移反应形成的超分子具有更强烈的共振光散射现象，建立了孔雀石绿共振光散射光谱测定半胱氨酸含量的新方法。建立的单波长共振光散射法和双波长叠加共振光散射法均具有较高的灵敏度和专属性，且省时高效、成本低廉，均符合食品中半胱氨酸定量分析的要求，其中双波长叠加共振光散射法比单波长共振光散射法更灵敏。