基于GC-MS代谢组学分析大鲵肉冷藏过程中肌肉代谢产物差异

金文刚，赵 萍，刘俊霞，兰阿峰，陈德经，裴金金,*，高瑞昌,2,4,*

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，秦巴生物资源与生态环境省部共建培育国家重点实验室，陕西 汉中 723001；2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；3.陕西理工大学 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723001；4.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

大鲵（Andrias davidianus）是我国人工繁育与养殖技术较为成熟的特种水生野生动物之一，具有极高的食用和药用价值[1-2]。目前，大鲵已在我国10多个省市实现了规模化养殖，但大鲵深加工与开发利用仍是养殖业提质增效的瓶颈[3-4]。当前，大多数研究集中在大鲵营养组成[2,5]、蛋白质特性[6-8]、功能活性物质[8-10]、贮藏保鲜[11-12]、热加工方便食品[5,13-14]等方面。一些养殖龙头企业也顺势推出了大鲵分割肉、大鲵蛋白肽、大鲵油以及日化用品（面膜、化妆品等），极大促进了大鲵产业链的延伸和转型发展。

冷鲜肉是指畜禽宰杀后的胴体经过冷却维持在0～4 ℃，并在此温度范围内加工、贮运、销售的肉类，一般都经历了较充分的解僵成熟过程，其肌肉代谢与食用品质的关系已得到较多阐释[15-16]。随着大鲵分割加工的产业化，大鲵分割鲜肉已成为最重要的初加工产品之一[17]。大鲵外形丑陋，分割鲜肉的上市消除了消费者宰杀大鲵的恐惧心理，但还需要在脱腥、品质提升和延长货架期等方面持续深入研究。辛茜等[17]利用顶空固相微萃取气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术分析了大鲵皮、肉和爪3 个部位的腥味成分。金文刚等[18]采用气相离子迁移色谱技术鉴定了大鲵不同可食部位（头、背、尾、腹、爪和肝脏）的挥发性气味成分及其差异。Hu等[12]研究了大鲵分割鲜肉通过不同比例气调包装冷藏过程中理化和食用品质的变化，探讨延长大鲵冷鲜肉的货架期。然而，大鲵宰后冷藏过程中肌肉代谢与肉品新鲜度、质构、色泽、保水性、感官品质的相关性亟需进一步研究。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成部分，它是以高通量检测技术和多元数据处理为手段，通过研究小分子代谢物（分子质量＜1 500 Da）的变化，进而探究其代谢机制的新兴科学[19]。代谢组学技术包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技术、GC-MS和高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）联用技术等[20]。GC-MS具有较高的分辨率、重现性和检测灵敏度，可实现多组学混合物中未知组分的定性分析，是目前代谢组学研究中最成熟的分析技术[21]。Argyri等[22]把顶空固相微萃取-GC-MS作为评估不同包装和温度条件下贮存的碎牛肉变质动态研究的工具，该研究通过化学计量学分析挥发性化合物的变化评估肉类变质。Mallouchos等[23]利用GC-MS对海鲷冷藏过程中的代谢物进行研究，发现一些差异代谢物可作为海鲷新鲜度流失和腐败变质的潜在生物标志物。

课题组前期探究了大鲵肉冷藏过程中挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、菌落总数等理化特性的变化，并明确了冷藏期间主要致腐微生物菌属为假单胞菌属、气单胞菌属、Hafnia-Obesumbacterium和沙雷氏菌属[24-25]。然而采用代谢组学技术研究大鲵肉冷藏过程中肌肉代谢产物的变化还鲜见报道。为此，本研究采用GC-MS技术分析大鲵肉在不同冷藏时间代谢物的变化，并结合多元统计方法筛选差异代谢物，分析相关代谢通路并探究理化指标与差异代谢物的相关性，以期为丰富大鲵肉冷藏过程中肌肉代谢信息以及冷鲜肉品质控制提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活健康子二代大鲵3 尾（（2.5±0.36）kg）汉中市龙头山大鲵养殖基地；妙洁保鲜膜（材质为聚乙烯，温度范围：－60～100 ℃） 市购。

甲醇（色谱级）、正己烷（色谱级）、吡啶、O-甲基羟胺盐酸盐（纯度为97%）、N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA）（含1%三甲基氯硅烷） 德国CNW公司；L-2-氯苯丙氨酸 上海恒创生物科技有限公司；辛酸甲酯C8:0、壬酸甲酯C9:0、癸酸甲酯C10:0瑞典Larodan公司；月桂酸甲酯C12:0、肉豆蔻酸甲酯C14:0、棕榈酸甲酯C16:0、硬脂酸甲酯C18:0美国Nu-chek公司；花生酸甲酯C20:0、山嵛酸甲酯C22:0、木蜡酸甲酯C24:0德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

BCD-649WE冰箱 山东青岛海尔股份有限公司；T-A3204B电子天平 上海精科天美科学仪器有限公司；F-060SD超声波清洗机 深圳福洋科技集团有限公司；TYXH-1涡旋振荡器 上海汗诺仪器有限公司；JXFSTPRP-24/32样品研磨仪 上海净信实业发展有限公司；LNG-T98冷冻浓缩离心干燥器 江苏省太仓市华美生化仪器厂；TGL-16MS高速冷冻离心机 上海卢湘仪仪器有限公司；THZ-82A气浴恒温振荡器 江苏省金坛市环宇科学仪器厂；DZF-6021真空干燥箱上海慧泰仪器制造有限公司；Trace 1310/TSQ 9000 GC-MS仪美国赛默飞世尔科技公司；DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

鲜活大鲵经放血、热烫（95 ℃处理约1 min）、刮黏液、去内脏，清洗后用聚乙烯袋20 min内运回实验室，去头、皮、四肢、尾，取背肌并切成约5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的肉块，放入黑色托盘中并用保鲜膜密封，置于4 ℃冰箱中冷藏0～8 d。基于前期研究中大鲵肉冷藏期间TVB-N、菌落总数、微生物多样性等信息[24-25]，分别于第0（新鲜）、2（新鲜与货架期之间）、4（货架期）、8天（腐败）取样，分别记为D0、D2、D4、D8，每个时间点取6 个平行。定时将样品取出，置于超净工作台上，去除保鲜膜，用事先灭菌好的剪刀将肉样剪碎，混匀，用镊子装在15 mL离心管中，置于－80 ℃冰箱贮藏待用。

1.3.2 样品前处理

参考Li Gang[26]和Li Xiaoou[27]等的方法并稍作修改，准确称取30 mg组织样品到1.5 mL离心管中，依次加入20 μL内标（0.3 mg/mLL-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液）和600 μL甲醇-水（4∶1，V/V）溶液。加入两个小钢珠，在－80 ℃冰箱中放置2 min，放入研磨机中60 Hz下研磨2 min，加入120 μL氯仿，涡旋2 min，然后置于冰水浴超声，40 kHz下提取10 min。－20 ℃静置30 min，4 ℃、13 000 r/min离心10 min，取100 μL上清液装入玻璃衍生瓶中。质控（quality control，QC）样品由所有样品的提取液等体积混合制备而成，QC体积与样品相同。用离心浓缩干燥器挥干样品，向玻璃衍生小瓶中加入80 μL 15 mg/mL甲氧胺盐酸盐吡啶溶液，涡旋振荡2 min，置于37 ℃振荡培养箱中90 min，进行肟化反应。将样品取出，再加入50 μL BSTFA（含1%三甲基氯硅烷）衍生试剂和20 μL正己烷，分别加入10种内标（10种脂肪酸甲酯，均为氯仿配制）各10 μL，涡旋振荡2 min，于70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。

1.3.3 GC-MS条件

色谱条件：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度≥99.99%），流速1.2 mL/min；进样口温度300 ℃；进样量1 μL，不分流进样；溶剂延迟5 min。升温程序：初始温度60 ℃，保持0.5 min；以8 ℃/min升温至125 ℃，保持5 min；5 ℃/min升温至210 ℃，保持5 min；10 ℃/min升温至270 ℃，保持5 min；20 ℃/min升温至305 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源，温度330 ℃；传输线温度280 ℃；扫描方式为全扫描模式，质量扫描范围为m/z50～500。

1.4 数据处理

将GC-MS得到的原始数据经Analysis Base File Converter软件转换为abf格式文件，之后导入MS-DIAL软件（下载途径：http://prime.psc.riken.jp/）进行峰检测、峰识别、MS2Dec反卷积、定性、峰对齐、滤波、缺失值插值等一系列处理。通过保留时间，精确分子质量，与LUG数据库（鹿明生物自主研发的数据库）匹配相似度对化合物定性[28]，最终导出原始数据矩阵，用于后续分析。使用Excel软件对数据进行统计；使用SPSS 25软件进行显著性分析，采用Duncan法进行多重比较（P＜0.05，差异显著）；使用SIMCA 14.1软件进行质控、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）；使用Origin 2021软件进行绘图；结合京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pathway数据库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）进行代谢通路富集相关分析。

2 结果与分析

2.1 大鲵肉不同冷藏期样品数据采集质控分析

将QC样品的总离子流图进行谱图重叠比较，如图1所示，QC样品的基线稳定，各色谱峰的保留时间基本一致，说明仪器数据采集稳定性较好[29]，在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。

图1 大鲵肉冷藏过程中QC样品的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatogram of QC samples of giant salamander meat during cold storage

PCA作为一种非监督数据分析方法，借助于一个正交变换，将其分量相关的原随机向量转化成其分量不相关的新随机向量，使它们尽可能多地反映原有的变量信息，达到降维目的，同时对系统稳定性进行评价[30]。理论上QC样品都相同，但是物质提取、检测分析过程中的系统误差，导致QC样品间有微小差异，差异越小说明整个方法稳定性越好数据质量越高，表现为在PCA得分图上QC样品聚集在一起。所有样品经7 次交叉循环验证的PCA得分图，如图2所示，大鲵肉QC样品相对聚集，QC样品间差异较小，实验过程中仪器检测稳定性较好，数据可靠。

图2 大鲵肉QC组和不同冷藏时期样品PCA得分图Fig. 2 PCA score plot of QC sample and experimental samples with different storage time

2.2 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的多元统计分析

2.2.1 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的PCA

对代谢物进行PCA，可总体反映样本组间和组内差异，观察样本间的总体分布趋势，判断可能存在的变异点。如图3所示，说明拟合性较好，Q2=0.566，与相差较小，说明拟合方程的稳定性较好。此外，4 个冷藏期大鲵肉样品中除冷藏8 d的两个样品外，其余样品都在95%置信区间内，冷藏0、2、4 d的样品在置信区间内相对聚集在第2、3象限内，可能是由于样品的代谢物具有相似性[30]。

图3 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的PCA得分图Fig. 3 PCA score plot of metabolites in giant salamander meat with different storage time

2.2.2 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的PLS-DA

图4 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的PLS-DA得分图（A）和响应排序检验（B）Fig. 4 PLS-DA score plot (A) and response permutation test (B) of metabolites in giant salamander meat with different storage time

虽然PCA能够直观显示样本间的分组、变化趋势和相似性关系，但差异变量会分布在PC上，无法在后面的分析中将其剔除进行更准确的分析，同时对相关性较小的变量不敏感。PLS-DA作为一种有监督的判别统计方法，加入了分组变量可弥补PCA方法的不足。PLS-DA模型中分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，越接近于1表示模型拟合度越好。如图4A所示，与图3相比，各冷藏期样品间聚集相对集中。Q2值分别为0.793、0.978、0.890，均大于0.5且接近1，说明建立的模型符合样品数据的真实情况并且能很好地解释样本之间的差异。为防止模型过拟合，采用200 次响应的置换检验对模型进行验证，其中R2、Q2为回归线与Y轴的截距值，R2表示模型能够解释的方差总和，Q2表示模型的预测能力，使用响应排序置换检验时，一般要求Q2小于0。由图4B可知，R2=0.675，Q2=－0.38，回归线呈线性关系，Q2小于0，没有出现过拟合的现象，表明模型可靠，可用于后续分析。此外，由图4A可知，冷藏8 d与冷藏0、2、4 d相比差异较大[26]，这可能是微生物在大鲵肉表面分布不均，大鲵肉的品质发生明显的变化所致[25]。

2.3 不同冷藏时间大鲵肉中差异代谢物的筛选与鉴定

采用多维分析和单维分析相结合的办法筛选组间差异代谢物。根据PLS-DA模型分析结果，筛选PC1的VIP值不低于1、t检验P值小于0.05的差异代谢物进行汇总，如表1所示。同时绘制所有差异代谢物的层次聚类热图，如图5所示。

表1 不同冷藏时间大鲵肉中差异代谢物筛选结果Table 1 Results of screening of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

续表1

图5 不同冷藏时间大鲵肉中差异代谢物层次聚类热图Fig. 5 Hierarchical clustering heatmap of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

由表1可知，大鲵肉在冷藏过程中的差异代谢物共计69种，包括有机酸类及其衍生物（21种）、氨基酸类及其衍生物（14种）、糖类及其衍生物（7种）、核苷酸类及其衍生物（10种）、胺类及其衍生物（6种）和其他类（11种）。由图5可知，层次聚类热图可将不同冷藏期大鲵肉样品分为3 类，即冷藏前期（0～2 d）、冷藏中期（4 d）、冷藏后期（8 d），冷藏8 d与冷藏0、2、4 d具有明显差异。

图6 不同冷藏时间大鲵肉中各类化合物累积相对丰度变化趋势图Fig. 6 Trend of cumulative relative abundance of various compounds in giant salamander meat during storage

有机酸类及其衍生物是大鲵肉冷藏过程中代谢物的重要组成部分，此类物质一部分来源于原料，另一部分来源于冷藏过程中肌肉的生化反应及微生物代谢[31]，由图6可知，有机酸类及其衍生物的累积相对丰度在冷藏0～4 d增加幅度较平缓，而在冷藏4～8 d急剧增加。由表1可知，有机酸类及其衍生物中葡萄糖酸、二甲基尿酸和异己糖酸的VIP值较大，分别为3.35、3.34和3.06，其余有机酸类代谢物的VIP值均小于2。丙酮酸是冷藏初期0 d样品中有机酸类化合物中相对丰度最高的代谢物，包括丙酮酸以及其余有机酸类及其衍生物相对丰度在整个冷藏过程中呈现波动，主要原因可能是在冷藏8 d微生物的群落结构发生了较大变化，优势菌属发生了演替，优势菌经过三羧酸循环、丙酮酸代谢等代谢途径，与其相关的差异代谢物相对丰度出现变化[32]。丙酮酸是氨基酸代谢途径中的关键节点化合物，能通过各种支链氨基酸转氨酶的作用形成醛、酮、醇，并参与微生物代谢[33]。富马酸、苹果酸在冷藏过程中相对丰度呈现一定波动，可能与细菌菌相构成变化有关[25]。同时，前期研究结果也表明，在冷藏8 d大鲵肉中的主要优势菌属为假单胞菌属[25]，有机酸或氨基酸是假单胞菌属的首选碳源[34]。

氨基酸类及其衍生物主要来自冷藏过程中细菌的蛋白酶对原料中蛋白质的酶促降解以及一些其他微生物的自溶作用[31]，由图6可知，氨基酸类及其衍生物的累积相对丰度在冷藏0～4 d呈先增后降趋势，而在冷藏4～8 d急剧增加。由表1可知，氨基酸类及其衍生物中L-高丝氨酸、L-焦谷氨酸和甘氨酸在第0天相对丰度较高，而且除了甘氨酸在冷藏0～8 d内相对丰度显著增加外（P＜0.05），其余氨基酸类代谢物在冷藏期间呈现一定波动规律。氨基酸类代谢物绝大部分是蛋白质代谢、降解和生物合成的中间产物，能为微生物的生长提供氮源。L-高丝氨酸的VIP值为2.77（表1），是氨基酸类及其衍生物中相对丰度最高且波动幅度较大的代谢物，对此类代谢物整体变化的趋势和幅度具有主导作用。L-高丝氨酸是苏氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚生物合成的中间产物，也存在于细菌的肽聚糖中，特别是冷藏2 d大鲵肉样品中L-高丝氨酸相对丰度显著高于冷藏0 d样品（P＜0.05），可能是由于苏氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚的生物合成受阻进而导致L-高丝氨酸的积累；而在冷藏4 d和8 d样品中L-高丝氨酸相对丰度呈先降后升的波动变化，主要由细菌的生长、繁殖所致[24-25,34]。甘氨酸、L-丝氨酸主要贡献甜味，L-蛋氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸主要贡献苦味[35]。L-蛋氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸等酸性氨基酸相对丰度在冷藏期的动态变化是样品自溶和细菌腐败协同的结果；L-赖氨酸、L-丝氨酸相对丰度在冷藏2～8 d降低可能表明他们从肌肉蛋白质中溶解速度比转化为副产物速度更慢[23]。L-蛋氨酸经分解代谢会形成甲硫醇、二甲基硫化物，这些物质与冷藏后期异味的形成密切相关[36]。

糖类及其衍生物是碳源的来源之一，在糖酵解过程被消耗，通过碳水化合物代谢途径为微生物提供必需的能量[37]，由图6可知，大鲵肉样品冷藏过程中糖类及其衍生物累积相对丰度变化较小。由表1可知，除了半乳糖、麦芽三糖的VIP值相对较高，分别为1.88、1.62，其余代谢物VIP值均低于1.5。糖类在冷藏初期主要发生有氧氧化，生成CO2和H2O，同时产生三磷酸腺苷；随着冷藏时间的延长，糖的无氧酵解逐渐发挥主导作用，代谢产生三磷酸腺苷和丙酮酸，引起糖类在冷藏过程中逐渐减少，丙酮酸积累。大鲵肌肉中糖或糖磷酸盐浓度的变化会导致鲜鱼气味逐渐流失，同时碳水化合物的减少会导致有机酸（如琥珀酸）和醇类（如乙醇）的增加[35]。

核苷酸类及其衍生物中嘌呤类化合物是细胞中最为丰富的代谢物，对提供细胞能量和细胞内信号传导起着重要作用，由图6可知，大鲵肉样品冷藏过程中核苷酸类及其衍生物累积相对丰度在整个冷藏期间呈缓慢下降的趋势。由表1可知，黄嘌呤、鸟嘌呤的VIP值相对较高，分别为1.97、1.66，其余核苷酸类化合物的VIP值均低于1.6。肌苷、腺苷、次黄嘌呤的相对丰度在冷藏0 d时相对较高。嘌呤代谢的中间产物中，黄嘌呤、黄嘌呤核苷在冷藏后期相对丰度显著增加（P＜0.05）。核苷酸类及其衍生物的变化，标志着大鲵肉的新鲜度逐渐流失。次黄嘌呤一方面由三磷酸腺苷降解产生（即自溶），另一方面由细菌活动产生。Hong等[38]指出一些细菌如假单胞菌属可将肌苷、肌苷酸转化为次黄嘌呤，且细菌次黄嘌呤的形成速度高于自溶。次黄嘌呤最终通过腐败菌的生长繁殖转化为黄嘌呤、尿酸等环状裂解产物[38-39]。嘧啶代谢的中间产物二氢尿嘧啶，终产物为尿素，嘧啶核苷酸中嘧啶碱的合成原料主要来自谷氨酰胺、CO2和天冬氨酸[40]。

胺类物质主要包括烟草胺、胍丁胺、5-羟基色胺等，由图6可知，大鲵肉样品冷藏过程中胺类物质累积相对丰度变化相对较小。由表1可知，烟草胺VIP值最大，为3.10，其余胺类代谢物VIP值均小于1.9；烟酰胺的相对丰度在冷藏0 d相对较高。其中，胍丁胺主要参与精氨酸、脯氨酸代谢，5-羟基色胺、5-甲氧基色胺主要参与色氨酸代谢，烟酰胺主要参与烟酸和烟酰胺代谢。

其他类化合物主要包括尿素、表儿茶素、没食子儿茶素、曲唑酮、水杨醛、肾上腺素等11种物质（表1），这类物质累积相对丰度在冷藏期间呈轻微增加趋势（图6）。尿素是最简单的有机化合物之一，是哺乳动物和某些鱼类体内蛋白质代谢分解的主要含氮终产物。由表1可知，尿素VIP值（1.47）在其他类化合物中较高，冷藏0 d样品相对丰度也较高，随着冷藏时间延长其相对丰度呈现增加趋势，在第4天达到峰值而在第8天有所降低，这是蛋白质逐渐降解代谢积累的结果。鞘氨醇是许多鞘脂类化合物的主体，包括神经酰胺，这些鞘脂主要参与多种细胞信号传导和病理功能，特别是在细胞凋亡和应激反应过程中[41]。

2.4 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的代谢通路富集分析

KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库[42]。通过KEGG数据库对差异代谢物进行富集分析，选择P＜0.05的代谢通路绘制气泡图，如图7所示，共富集到21 条代谢通路。其中，气泡的大小表示富集代谢物个数的多少，气泡越大表示富集的代谢物越多；富集因子为显著差异代谢物个数与该通路中总代谢物个数之比，富集因子越大，说明富集程度越大；颜色由绿到蓝表示P值依次降低。由图7可知，富集代谢产物最多、P值较小的前5条代谢通路分别为嘌呤代谢、氨酰-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢、三羧酸循环。利用KEGG等权威代谢物数据库映射，得到具有显著差异（P＜0.05）的代谢物33种，具有极显著差异（P＜0.01）的代谢物32种。具有显著差异的21 条代谢通路和33种代谢物的富集关系如图8所示。

图7 不同冷藏时间大鲵肉中差异代谢物的KEGG富集图Fig. 7 KEGG enrichment analysis of differential metabolites in giant salamander meat with different storage time

图8 不同冷藏时间大鲵肉中差异代谢物及其代谢通路的富集关系图Fig. 8 Relationship between differential metabolites and metabolic pathway enrichment of giant salamander meat with different storage time

由图8可知，丙酮酸、琥珀酸、富马酸、甘氨酸、丝氨酸是参与代谢通路较多的化合物，在连接各通路和代谢物上具有重要的作用，所涉及到的代谢通路中绝大部分为氨基酸代谢通路和能量代谢通路。将所有差异代谢物按它们在冷藏过程中的变化趋势分为3 类：A类化合物：在冷藏8 d相对丰度显著增加（如图8红色方框所示）；B类化合物：在冷藏0、2 d相对丰度较高（如图8蓝色方框所示）；C类化合物：没有明确的变化趋势（如图8绿色方框所示）。对3 类化合物进行累积分析，如图9所示。

图9 不同冷藏期大鲵肉差异代谢物累积分析Fig. 9 Change in relative abundance of differential metabolites in giant salamander meat during storage

由图9可知，A类化合物的累积相对丰度在冷藏0、2、4 d内轻微增加，而冷藏4～8 d上升幅度急增，以氨酰-tRNA代谢通路中差异代谢物最多。有研究将氨酰-tRNA合成酶作为抗菌类药物的靶点[43]，该类化合物在冷藏4～8 d快速增加与冷藏后期优势腐败微生物的大量繁殖及微生物群落结构的改变密切相关。B类化合物累积相对丰度在0～8 d冷藏期内呈平稳下降趋势，以嘌呤代谢通路中差异代谢物最多；该类化合物在整个冷藏过程中的下降趋势与大鲵肉在冷藏过程中鲜度的流失密切相关。C类化合物中富马酸、尿素、甘油酸、L-高丝氨酸参与的代谢途径较多，其他化合物参与的代谢途径较少；C类化合物累积相对丰度在冷藏过程中呈一定的波动性，可能是由能量代谢、蛋白质代谢、中间产物和微生物菌群演替交互作用所致[24-25,34]。

2.5 不同冷藏时间大鲵肉中代谢物的相关性分析

选取图9中A类和B类化合物中相对丰度大于1的代谢物与课题组前期研究结果（TVB-N值、菌落总数、致腐微生物菌属）[24-25]进行Pearson相关性分析，如图10所示。

由图10可知，B1类化合物与TVB-N值、菌落总数、致腐微生物呈负相关；其中L-丝氨酸与假单胞菌属、气单胞菌属、Hafnia-Obesumbacterium呈显著负相关（P＜0.05）；L-赖氨酸与气单胞菌属、Hafnia-Obesumbacterium呈显著负相关（P＜0.05）。A1类化合物与TVB-N值、菌落总数、致腐微生物呈正相关；除乙酰鸟氨酸外，均与TVB-N值呈显著正相关（P＜0.05），以L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸的相关性较强（P＜0.01）；甘氨酸、丙酮酸、乙酰鸟氨酸与菌落总数呈显著正相关（P＜0.05），以甘氨酸相关性较强（P＜0.01）。因此，可将L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸和甘氨酸作为大鲵肉冷藏品质变化的潜在标记物。已有报道采用同位素标记相对和绝对定量结合HPLC-MS对乳制品氨基酸的种类及含量进行分析[44]，此外通过传感器阵列和纳米姜黄素也可实现生物样本中氨基酸的定量和分化[45]。大鲵肉冷藏期间品质变化的上述潜在标记物与新鲜度的直接关系还需要在实际冷藏环境下建立可行的标记方法验证其可靠性。

图10 不同冷藏时间大鲵肉理化指标与差异代谢物相关性分析Fig. 10 Correlation analysis between physicochemical indexes and differential metabolites in giant salamander meat during storage

3 结 论

采用GC-MS非靶向代谢组学技术结合多元统计分析方法，对不同冷藏时间（0、2、4、8 d）大鲵肉中的代谢物进行研究。结果表明，大鲵肉在冷藏过程中的差异代谢物共计69种，包括有机酸类及其衍生物（21种）、氨基酸类及其衍生物（14种）、糖类及其衍生物（7种）、核苷酸类及其衍生物（10种）、胺类及其衍生物（6种）和其他类（11种）。层次聚类热图可将不同冷藏期大鲵肉样品分为3 类，即冷藏前期（0～2 d）、冷藏中期（4 d）和冷藏后期（8 d）。KEGG富集分析表明，在大鲵肉冷藏期间较为重要的代谢通路为嘌呤代谢、氨酰-tRNA生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、丙酮酸代谢、三羧酸循环。代谢通路映射及Pearson相关性分析表明，L-赖氨酸、L-丝氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、丙酮酸、丁二酸和甘氨酸可作为大鲵肉品质变化的潜在标记物。