化学交联改性对高链玉米淀粉体外大肠发酵特性的调控机制

刘峻恺，王绍康，顾志鹏，扶 雄，黄 强，张 斌,*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510630；2.中新国际联合研究院，广东 广州 510700）

肠道菌群是一系列古细菌、真菌、真核生物等组成的复杂微生物群落总称。作为一个被遗忘的人体“器官”[1]，它可以通过定植抗性、养分分解、刺激宿主细胞等免疫功能发挥作用。肠道微生物受多种因素的影响，包括基因、环境、母体菌群组成、年龄、饮食等[2-3]。其中，饮食干预是日常主要调节手段。

淀粉作为人们日常生活中的主要能量来源，其对肠道菌群的调节作用值得关注。抗性淀粉通常指不被胃和小肠消化，可抵达大肠被结肠细菌发酵的淀粉总和。抗性淀粉根据其来源可以大致分为物理包埋淀粉、抗性淀粉颗粒、老化淀粉、化学改性淀粉、淀粉-脂质复合物五大类[4]。据报道，淀粉颗粒的结晶区和无定型区可在大肠发酵中同时均匀地被降解，发酵模式是从淀粉颗粒表面腐蚀，而后逐步渗透到颗粒内部[5]。Wang Shaokang等[6]通过研究单一化学交联淀粉体外粪菌发酵，指出丁酸的生成量与化学交联淀粉的交联度呈反比，且中低交联度淀粉能够促进包含Blautia和Clostridiales在内的不同有益菌生长。

虽然已有研究探明交联淀粉在调控菌群方面有差异性[7-8]，但交联基团种类和交联度对菌群改性的影响仍需进一步探究。因此，本研究以高链玉米淀粉（highamylose maize starch，HAMS）为原料，分别使用包括三偏磷酸钠（sodium trimetaphosphate，STMP）、三氯氧化磷（phosphoryl chloride，POCl3）和环氧氯丙烷（epichlorohydrin，EOH）在内的3种不同类型化学交联剂制备交联淀粉，旨在探讨不同类型化学交联淀粉的体外大肠酵解特性及其对肠道菌群影响的异同，进一步为功能性膳食纤维的开发提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HAMS（Hylon V，直链淀粉45%） 上海宜瑞安公司；STMP、POCl3、EOH 上海麦克林公司；葡萄糖氧化酶过氧化物酶试剂盒 爱尔兰 Megazyme公司；猪胰α-淀粉酶（8×USP/mg） 美国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪 美国安捷伦公司；MR-Hei-Tec型加热型磁力搅拌器 德国Heidoiph公司；EVO18扫描电子显微镜 德国蔡司公司；HYQX-II型厌氧箱上海跃进公司。

1.3 方法

1.3.1 交联淀粉的制备

1.3.1.1 STMP交联淀粉的制备

参考Woo等[9]的方法并稍作修改。准确称取20 g HAMS（干基）于烧杯中，加入蒸馏水调配成35 g/100 mL的淀粉乳，并加入2 g Na2SO4（抑制淀粉膨胀）后搅拌均匀。添加3%、6%、12%（以淀粉干基质量计）STMP后，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH 11.0，45 ℃恒温搅拌3 h。反应结束后用0.1 mol/L HCl溶液调节pH 6.5，终止反应。用蒸馏水洗涤4 次，无水乙醇清洗3 次后离心，40 ℃恒温烘干，过100 目筛备用。组内样品根据交联剂添加量分别命名为S1、S2、S3，分别代表低、中、高STMP交联改性的淀粉样品。

1.3.1.2 POCl3交联淀粉的制备

参考Felton等[10]的方法并稍作修改。准确称取20 g HAMS（干基）于烧杯中，加入蒸馏水调配成35 g/100 mL的淀粉乳，加入3 g Na2SO4后搅拌。加入0.5%、1%、2%（以淀粉干基质量计）POCl3，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH 11.5，25 ℃恒温搅拌1 h。反应结束后用0.1 mol/L HCl溶液调节pH 5.5，后续过程同于1.3.1.1节。组内样品根据交联剂添加量分别命名为P1、P2、P3，分别代表低、中、高POCl3交联改性的淀粉样品。

1.3.1.3 EOH交联淀粉的制备

参考Thomas等[11]报道的方法并稍作修改。准确称取20 g HAMS（干基）于烧杯中，加入蒸馏水或去离子水调配成35 g/100 mL的淀粉乳，并加入2 g Na2SO4。添加1%、2%、4%（以淀粉干基质量计）EOH后，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH 11.5，25 ℃恒温搅拌14 h。反应结束后用0.1 mol/L HCl溶液调节pH 5.5，后续过程同于1.3.1.1节。组内样品根据交联剂添加量分别命名为E1、E2、E3，分别代表低、中、高EOH交联改性的淀粉样品。

1.3.2 交联度的测定

交联度高低分别以磷含量（STMP交联淀粉、POCl3交联淀粉）[6]和沉降积（EOH交联淀粉）[12]表示。

1.3.2.1 结合磷含量

准确称取0.4 g样品于100 mL消化瓶中，加入1∶1（V/V）的硝酸-硫酸混合液15 mL，放置于加热器上消化至溶液微沸、瓶口出现棕色气体并最终变为白色、溶液澄清透明为止。消化结束后，待液体冷却，加入45 mL水，使用10 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.0，并定容至100 mL。

取上述容量瓶内反应液25 mL，放置于锥形瓶内，依次加入4 mL钼酸铵溶液，2 mL抗坏血酸溶液，加完立即混匀，测定吸光度后根据磷标准溶液曲线确定磷含量[13]。

1.3.2.2 沉降积

分别称取0.5 g不同交联淀粉样品，加入25 mL蒸馏水调配成2 g/100 mL的淀粉乳，将烧杯放于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃加热30 min，取出冷却至室温，向两只10 mL离心管中倒入均匀搅拌后的冷却淀粉乳，4 300 r/min离心2 min，读取上清液体积。按式（1）计算沉降积[12]：

式中：V为上清液体积/mL；10为所取淀粉乳体积/mL。

1.3.3 抗性淀粉含量测定

准确称取600 mg淀粉样品于50 mL离心管中，添加20 mL pH 5.2的0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液和5 粒玻璃珠。涡旋混匀后加入5 mL含有猪胰酶和淀粉转葡萄糖苷酶的混酶，置于37 ℃恒温水浴中进行孵育。反应120 min后取0.25 mL水解液，加入10 mL无水乙醇停止反应。使用葡萄糖氧化酶过氧化物酶检测试剂盒定量测定120 min淀粉释放的葡萄糖含量[14]。抗性淀粉含量的计算如式（2）所示：

式中：G120为淀粉酶水解 120 min 后产生的葡萄糖含量/mg；TG为样品的总葡萄糖含量/mg。

1.3.4 X射线衍射分析

将待测淀粉粉末样品放入X射线衍射仪样品台中进行测试，采用波长为0.154 2 nm的CuKα射线进行连续扫描。测试管压为40 kV，管流为40 mA，衍射角（2θ）扫描区域为4°～30°，扫描步长为0.02°，扫描速率为0.0131°/s。相对结晶度被量化为晶体面积与总面积的比值，通过Peakfit软件（版本7.0）进行计算。

1.3.5 体外大肠酵解模型

体外酵解实验参照Kaur等[15]的方法进行修改。配制碳酸磷酸盐缓冲液，121 ℃高压灭菌20 min后加入0.25 g/L半胱氨酸盐酸盐，趁热通入二氧化碳去除微量氧。将缓冲液放入厌氧箱内过夜。准确称取50 mg淀粉样品（干基）于带有橡胶塞的厌氧瓶中，同时称量50 mg低聚果糖（fructooligosaccharides，FOS）为阳性对照，空瓶为空白对照组。

将3 份等量的新鲜粪便样品与预先灭完菌的碳酸磷酸盐缓冲液按1∶6（mg/mL）比例混合，并用4 层滤布过滤后得到菌液。分别向厌氧瓶中加入1 mL菌液和4 mL碳酸磷酸盐缓冲液，使用灭菌后的橡胶塞盖紧，并用铝箔盖进一步固定。37 ℃酵解8、12 h和24 h测定酵解后产气量[15-16]。将混合物离心后的淀粉酵解残渣样品均匀分装于3 个2 mL离心管中，于－80 ℃低温冷冻保存，用作16S rRNA基因测序。上清液留存于离心管中用于后续短链脂肪酸检测。

1.3.6 短链脂肪酸含量测定

对不同时间点的淀粉酵解残渣样品解冻后，13 000 r/min离心5 min。将上清液平均转移至3 个2 mL离心管中。配制内标混合物（四甲基戊酸、偏磷酸、五水硫酸铜），然后将200 μL的内标混合物加入800 μL离心后上清液中。实验检测配备极性的Zebron ZB-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）以及前火焰离子化检测器。升温程序：初始柱温为80 ℃，以8 ℃/min速率上升到190 ℃，并在192 ℃保持3 min。检测器的温度设置在230 ℃。用氮气作为载气，流速为1 mL/min。实验结束后，记录峰面积，根据脂肪酸标准品中内标（四甲基戊酸）与目标脂肪酸的峰面积之比求得矫正因子，并根据样品中各短链脂肪酸的相对峰面积进行定量计算。

1.3.7 16S rRNA基因测序分析

序列数据分析主要通过微生物生态学定量分析平台（Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2，QIIME2）和R软件包（v4.1.2）进行[17]。采用demux插件对原始序列数据进行解复用，随后使用cutadapt插件对引物进行切割，然后使用扩增子序列处理方法（divisive amplicon denoising algorithm 2，DADA2）对序列进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去除嵌合体[18]。它不再以相似度聚类，只进行去重或相当于以100%相似度聚类。使用DADA2质控后产生的每个去重序列称为特征序列（amplicon sequence variants，ASV）。本研究中，将具有超过3 000 片段的ASV命名为“大量存在的ASV”或者“丰富ASV”，而“关键 ASV”是二维空间长度大于描述符的平衡圆半径、在二维空间贡献最大、将在决定细菌群落结构起到至关重要作用的ASV。

采用β多样性分析研究微生物群落结构变化，并通过主成分分析（principal component analysis，PCA）基于物种丰度矩阵进行降维可视化。利用元基因组分析仪软件（MEGAN）[19]和图解系统发育分析软件（GraPhlAn）[20]，其分类学组成和丰度进行了可视化分析。通过Metastats法[21]比较各样品或分组在门和属水平上的丰度并以柱状图展现。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 抗性淀粉含量及交联度的测定

沉降积与交联度呈线性负相关，这是由于淀粉经交联以后其黏度和其疏水性质有所改变所致[22]。由图1可知，同为磷酸酯淀粉，POCl3交联淀粉组（P组）在交联剂用量为0.1%下可得到与STMP交联淀粉组（S组）交联剂用量为3%的同磷含量的交联淀粉，这可能是由于POCl3在淀粉乳中与水结合生成的正磷酸含3 个磷酸基团，能够更多地进入淀粉表面缝隙取代氢键，将不同的淀粉分子羟基或同一淀粉分子中两个不同部位的羟基经与同一个磷酸分子发生酯化反应联结在一起，形成酯键[23]。

交联反应前后的抗性淀粉含量如表1所示。HAMS因其较高的直链淀粉含量及紧密堆积的淀粉颗粒表面结构使其具备较高的酶抗性[24]，其抗性淀粉质量分数约为60%。对于低交联度淀粉样品（P1、E1），其抗性淀粉含量会略有降低，这可能与它们破坏了淀粉的短程有序性有关[6]。对于中高交联度的淀粉样品，引入的化学键阻碍了α-1,6和α-1,4糖苷键及相邻支点与淀粉酶的接触，从而使其抗性淀粉含量较原淀粉明显提高[25]。据报道，引入的交联剂主要分布于淀粉颗粒表面[26]，EOH交联淀粉组（E组）和P组相对于S组在高交联度时有更高的抗性淀粉含量，这可能是由于POCl3和EOH为液体，导致它们能在淀粉-交联剂体系中更多地到达淀粉分子颗粒表面缝隙处或扩散至颗粒基质中[27]，增加化学键取代氢键的程度，达到更稳定的交联效果[28]。

图1 交联淀粉沉降积Fig. 1 Sedimentation volume of chemically crosslinked starches

表1 样品改性前后磷及抗性淀粉含量Table 1 Phosphorus and RS contents of chemically crosslinked starches

2.2 X射线衍射

图2 化学交联淀粉X射线衍射曲线Fig. 2 X-Ray diffraction profiles of chemically crosslinked starches

由图2可知，HAMS为典型的B型结晶淀粉，其在15.26°、17.21°、19.75°、22.32°、24.08°有明显的衍射峰[29]。交联前后结晶度略有降低，这是由于碱性反应环境和交联剂共同作用[30]。研究表明，当使用更高质量分数的 POCl3时，一些淀粉颗粒在通道和中央空腔的表面或附近以及中央空腔周围区域发生交联[31]，这证明POCl3交联淀粉结晶度降低更多。交联前后淀粉晶型没有改变，证明三种交联反应主要发生在无定形区[32]。

2.3 产气量测定结果

图3 化学交联淀粉在体外酵解过程中的产气量变化Fig. 3 Gas production during the in vitro fecal fermentation of chemically cross-linked starches

如图3所示，FOS组作为本实验的阳性对照，其在发酵初期（0～8 h）产气迅速，发酵全程产气量最高（P＜0.05），与其易发酵特性一致[33]。这种快速发酵的底物，过多食用会导致胀气等一系列胃肠道不适[34]。

与FOS组相比，淀粉样品在所有发酵时间点都显示明显较低的产气量。交联淀粉发酵缓慢，并且随着交联度的增高，其产气量逐渐降低（P＜0.05），交联对产气抑制效果在E组中表现最为明显，这可能是由于EOH在交联时不仅存在淀粉颗粒表面，同时也扩散至颗粒内部，造成其由外到内均匀的交联模式[27]，增加对肠道菌群分泌酶的抵抗力，使得其产气量明显降低，这与表1中其抗性淀粉含量最高呈良好一致性。发酵后半阶段（12～24 h），交联淀粉组产气量趋于一致，这可能是由于淀粉表面的致密性被破坏，交联形成的化学键被分解所致。相同交联度下，相比S组和P组，E组的发酵速率最低（P＜0.05）。这种缓慢而稳定的发酵底物可以被肠道菌群均匀发酵，满足远端结肠能量需求[35]。高交联度淀粉（S3、P3、E3）在整个发酵过程中产气量最低，说明交联度可以有效控制肠道微生物内发酵程度。

2.4 短链脂肪酸产量

如图4所示，经过24 h发酵，与HAMS组和FOS组相比，交联淀粉组的乙酸和总酸产量规律一致，均呈现随着交联度的增高，产酸量逐渐降低的趋势。交联淀粉的抑制产酸作用主要发生在发酵初期（0～8 h），这是由于交联反应主要发生在淀粉颗粒表面，其对细菌分泌的酶具有一定的抗性。而一旦表面的交联基团被微生物所破坏，其淀粉残渣则可在后续阶段快速发酵，这也解释了交联淀粉前期总酸差异大而后期差异趋势逐渐减小的现象。丙酸产量在发酵后半阶段明显增加，可能是因为交叉喂养使肠道微生物在发酵初期产生的乙酸逐步转化为丙酸所致[36]。

图4 化学交联淀粉在体外发酵过程中的产酸量变化Fig. 4 SCFA production during in vitro fecal fermentation of chemically crosslinked starches

FOS组作为阳性对照，其丙酸产量在发酵末期达到最高，这与前人研究结果相一致[37]。与HAMS组相比，交联淀粉组在低交联度（S1、P1、E1）时均可以促进丙酸的生成。但值得注意的是，E组相对于S组和P组，其丙酸产量和交联度之间的剂量效应关系更为明显，这可能是醚化淀粉不含磷基团但同时能加强淀粉抗性的独特特性从而使增殖定向菌群所致。

丁酸被认为是对人体健康有益一种短链脂肪酸，如抑制炎症、抗癌、增强结肠屏障及减少细胞氧化应激[38]。FOS组在整个发酵期间丁酸产量最低，这主要与FOS在肠道内定向促进双歧杆菌的生长有关，双歧杆菌作为优势菌群促使淀粉分解生成琥珀酸，进一步通过丙酸-琥珀酸的转化途径生成丙酸。值得注意的是，与其他交联淀粉抑制所有酸产生所不同，E组交联淀粉显著促进丁酸生成（P＜0.05），且与交联度的增加无关，这可能是由于发酵过程中醚化淀粉对菌群的特异性调控所导致。

2.5 物种丰度变化

图5 化学交联淀粉经 24 h体外发酵后肠道菌群门（A）和属（B）水平丰度变化Fig. 5 Changes in the abundance of intestinal microbiota at the phylum (A) and genus (B) level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starches

不同交联淀粉发酵24 h后肠道菌群相对丰度如图5所示，空白组为未加入样品的原始菌群组。由门水平可知（图5A），不同交联淀粉均主要由Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria和Fusobacteria组成，其中，Firmicutes占比最高。与空白组相比，FOS组中Actinobacteria相对丰度大幅增多，其Actinobacteria和Firmicutes数量占比达70%以上。HAMS组和交联淀粉组的整体规律性一致，即Firmicutes与Actinobacteria相对丰度均增加，同时交联反应可以抑制Actinobacteria相对丰度。

为获得细菌群落的主要差异，选取相对丰度前20的属进行比较（图5B）。与空白组相比，交联淀粉组均提高了Roseburia、Ruminococcus等有益菌的丰度。而FOS组主要促进了Roseburia、Bifidobacterium和Bacteroides的增殖。

但不同交联淀粉组中菌群相对丰度变化与交联度之间的剂量效应关系并不相同。交联淀粉可以通过促进产丁酸的共生Firmicutes积极调控肠道微生物的组成及功能[39]。Roseburia和Ruminococcus这两种关键利用抗性淀粉盛产丁酸的厚壁菌属，其相对丰度在E组中呈随交联度增加而增加的趋势，这正是E组淀粉发酵过程中高丁酸产量的重要原因。

FOS组促进偏好利用寡糖和单糖类底物的Bifidobacterium[40]大幅增长，而交联淀粉组则无此趋势，对于主要分解利用纤维底物的Bacteroides，S组交联度与其相对丰度呈正相关，而E组交联度则与其并无良好的相关性，P组淀粉交联度与前5 位特征菌属相对丰度均无良好相关性。

2.6 ASV水平物种丰度变化

图6 化学交联淀粉经24 h体外发酵后肠道菌群ASV水平丰度变化Fig. 6 Changes in the abundance of intestinal microbiota at the ASV level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starch

为进一步探讨菌群ASV水平组成的变化，选取丰度排名前20的ASV绘制热图。如图6所示，与属水平结果一致，与初始菌群（空白组）相比，FOS组显著促进ASV-5617-Bifidobacterium（P＜0.05）。交联淀粉组经过24 h发酵后相对于显著增加ASV-7474-Lachnospiraceae（P＜0.01），降低ASV-10721-Dialister与ASV-13299-Oscillospira（P＜0.01），这两者通常与急性肠炎及一些慢性疾病有关联[41]。

不同交联淀粉所调控的菌群在ASV水平上的变化不完全相同。磷酸酯交联淀粉（S组和P组）可以显著促进ASV-Ruminococcus增殖，EOH交联淀粉则可以显著促进ASV-Roseburia增殖，这两种厚壁菌的增殖均与交联度正相关。间接反映了不同交联基团和反应模式对菌群有不同的促进方式。

2.7 PCA

图7 化学交联淀粉经 24 h体外发酵后肠道菌群 ASV水平的PCA图Fig. 7 Principal component analysis (PCA) plot for intestinal microbiota at the ASV level after 24 h in vitro fermentation of chemically cross-linked starches

如图7所示，2 个PC共解释了样本间79.4%的变化（PC1 52.4%，PC2 27%）。其中FOS组、空白组和交联淀粉组的“关键ASV”在图中存在明显的分离，表明不同底物成分对肠道菌群组成的影响不同。其中FOS组对ASV-5617-Bifidobacterium有促进作用，交联淀粉组显著促进了ASV-8874-Ruminococcus与ASV-4517-Roseburia，这两种均与高浓度膳食纤维摄入有关，其中乙酸和乳酸为其主要代谢产物，可以进一步通过交叉喂养转化生成丁酸[42]。

在交联淀粉组中，所有磷酸酯交联淀粉和低用量EOH交联淀粉在PC1上的距离较近，证明其具有相似的微生物群落结构，这与菌群属水平丰度结果一致。但中、高用量的EOH交联淀粉（E2，E3）与磷酸酯交联淀粉、高链玉米原淀粉和低用量EOH交联淀粉有明显差距，可以更多促进ASV-4517-Roseburia的增长，这与其丁酸产量增多的结果一致。

3 结 论

不同交联剂制备的化学改性淀粉在调控大肠发酵方面趋势一致，均可有效减缓淀粉的体外发酵速率，并能促进Ruminococcus、Roseburia等有益菌的生长。其中，EOH交联淀粉丁酸产量最高且与交联剂无剂量效应关系，而磷酸酯交联淀粉短链脂肪酸产量则与交联度呈反比。STMP和POCl3交联淀粉均随着交联剂用量升高，Roseburia相对丰度提升率降低，EOH交联淀粉则呈现相反的趋势。同时，交联能够在发酵初期显著抑制淀粉发酵速率。因此，化学交联淀粉具备一定的益生元效应，可以将更多的淀粉输送到远端结肠进行发酵，促进有益菌生长并促进短链脂肪酸释放。不同交联基团化学交联淀粉可以定向调控不同菌群，且剂量效应关系取决于所使用的交联剂种类。