不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

梁山泉，张登娅，杨绍青，何 滋，刘 丹，江正强

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，中国轻工业食品生物工程重点实验室，北京 100083）

人乳寡糖是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第3大固体成分，含量为5～15 g/L[1]。在人乳寡糖中，2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）含量最高，达31%[2]。研究表明，2’-FL具有许多生理功能，包括益生元活性、防止病原体黏附、肠上皮细胞反应调节剂、免疫调节剂、预防坏死性小肠结肠炎和促进大脑发育等[3]。目前2’-FL已成为婴幼儿配方奶粉核心配料的研究热点。2’-FL的主要获取方法包括从母乳中提取、化学合成、酶法合成和微生物合成[4]。相较于其他3种方法，微生物合成法更具有经济性和高效性，是合成2’-FL最有潜力的方法[5]。大肠杆菌（Escherichia coli）具有清晰的遗传背景和丰富的遗传操作工具，是目前用于微生物合成2’-FL最多的底盘细胞[6]。2’-FL的微生物合成是在α-1,2-岩藻糖基转移酶的作用下，将岩藻糖从鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）-L-岩藻糖转移到乳糖上。GDP-L-岩藻糖是2’-FL合成过程中关键前体物，已经确定了两种不同的合成途径：从头合成途径和补救合成途径。大肠杆菌自身能通过内源性从头途径合成GDP-L-岩藻糖，主要涉及磷酸甘露糖变位酶（phosphomannomutase，manB）、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶（mannose-1-phosphate guanyltransferase，manC）、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，Gmd）和GDP-L-岩藻糖合酶（GDP-fucose synthase，WcaG/FuI）[7]。补救合成途径中，在双功能酶L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶（fucose kinase/fucose-1-phosphate guanylyltransferase，FKP）的作用下将岩藻糖转运到胞内并合成GDP-L-岩藻糖[8]。

两种合成GDP-L-岩藻糖的途径都通过许多代谢工程改造提高2’-FL的产量。在大肠杆菌中过表达GDP-L-岩藻糖从头合成途径基因，2’-FL产量为1.23 g/L[9]。Huang Di等[10]过表达GDP-L-岩藻糖从头途径基因，并通过调节辅因子鸟嘌呤-5’-三磷酸（guanine-5’-triphosphate，GTP）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的供给、优化前体物质的供应（敲除lacZ、wcaJ和编码Lon蛋白酶的基因lon）、筛选更高效的菌株和岩藻糖基转移酶，大肠杆菌重组菌2’-FL产量提高了近10 倍，达9.12 g/L。此外，在大肠杆菌中引入了GDP-L-岩藻糖合成的补救途径，对内源性乳糖操纵子修饰，通过敲除岩藻糖异构酶和岩藻糖激酶的fucI-fucK基因簇增加岩藻糖的供给，2’-FL产量显著提高到23.1 g/L[11]。除了增加GDP-L-岩藻糖和乳糖的供给、减少旁路代谢通路的碳流量、增加α-1,2-岩藻糖基转移酶的可溶性表达外，平衡合成通路中基因表达强度也是提高2’-FL产量的一个重要策略。通过改变质粒拷贝数，调整基因表达强度从而使重组菌2’-FL的产量从2.28 g/L提高到2.52 g/L[12]。通路配置可用于调整基因的表达强度，与改变质粒拷贝数不同的是，其将多个基因组织成操纵子、假操纵子和单顺反子形式进行表达[13]。作为一种调节多个基因的便捷方法，通路配置已在提高多种化合物的合成中应用，如类黄酮、丁醇和白藜芦醇等[13-15]。但目前尚没有关于通路配置对合成2’-FL影响的报道。

本研究首先在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中构建2’-FL的从头合成通路，再利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除lacZM15序列和wcaJ增加2’-FL产量，之后基于通路配置进一步提高2’-FL产量，旨在为2’-FL的生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

TransStart FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖 北京擎科新业生物技术有限公司；DNA Marker 北京博迈德基因技术有限公司；琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒 美国Axygen公司；无缝克隆试剂盒C112、C113 南京诺唯赞生物科技股份有限公司；高纯度质粒小量提取试剂盒 北京天根生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）、卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、大观霉素、硫胺素 美国Inalco公司；2’-FL标准品（纯度≥95%） 上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

LB液体培养基、LB琼脂固体培养基、改良的M9培养基参照文献[16]的方法配制。分批补料培养基参照文献[17]的方法配制。

1.2 仪器与设备

T100聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 美国Bio-Rad公司；BG-Power 600电泳仪 北京百晶生物技术有限公司；凝胶成像分析系统 北京赛百奥科技有限公司；BSA124S天平美国Ohaus公司；HWS-26恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；移液枪 德国Eppendorf公司；ZQLY-180N摇床 上海知楚仪器有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪美国Agilent公司；BIOTECH-10JG-7000A发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司；Q ExactiveTM质谱仪美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 质粒构建

根据文献[13,18]的方法构建质粒pETDuet-BCGF、pCDFDuet-futC、pETDuet-CBGFF-gene cluster、pETDuetmanB-futC-operon、pETDuet-manB-futC-pseudo operon和pETDuet-manB-futC-monocistronic。实验所用菌株和质粒的信息如表1所示，引物和测序均由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

表1 本研究所用菌株与质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3.2 基因敲除

采用Jiang Yu等[19]建立的pTargetF和pCas双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统。得到lacZM15序列敲除的菌株BS-1和wcaJ敲除的菌株BS-2。

1.3.3 摇瓶发酵

将重组质粒pETDuet-BCGF和pCDFDuet-futC共转化至大肠杆菌BL21 Star (DE3)、BS-1和BS-2感受态细胞中，分别得到菌株BS-3、BS-4和BS-5。将重组质粒pETDuet-BCGFF-gene cluster、pETDuet-manB-futC-operon、pETDuet-manB-futC-pseudo operon和pETDuetmanB-futC-monocistronic转化至BS-2感受态细胞中，分别得到菌株BS-6、BS-7、BS-8和BS-9。鉴定正确的阳性克隆子挑取至LB液体种子培养基（含有相应的抗生素），37 ℃、200 r/min过夜培养作为种子液。取1 mL种子液加入到含50 mL M9培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培养至OD600nm=0.6～0.8，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG。培养2 h后加入乳糖至10 g/L，25 ℃培养72 h，定时取样，使用HPLC定量检测2’-FL的产量。

1.3.4 分批补料发酵

挑取BS-9单菌落于5 mL LB培养基（含有相应的抗生素）中，37 ℃、220 r/min培养10 h。取3 mL于300 mL分批补料培养基中，37 ℃、220 r/min培养10 h，作为种子液。10 L发酵罐中加入3.7 L分批补料培养基及300 mL种子液，25 ℃、800 r/min培养至甘油消耗完全，分别加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG和20 g/L乳糖。采用溶氧联动补料的策略（溶氧≤30%），维持pH 6.8，诱导表达后每6 h取样1 次。

1.3.5 生物量测定

以分批补料培养基作为对照，发酵液稀释到适当浓度于600 nm波长下测定菌体光密度。按式（1）计算细胞干质量（dry cell weight，DCW）[20]：

1.3.6 乳糖和2’-FL含量测定

发酵液沸水浴10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤器，使用HPLC进行定量分析。HPLC条件：Rezex ROA-Organic Acid H+（8%）色谱柱（300 mm×7.8 mm）；柱温60 ℃；流动相为5 mmol/L硫酸溶液，流速为0.6 mL/min；进样体积为10 μL。采用示差折光检测器，检测器温度35 ℃。按式（2）计算乳糖转化率：

1.3.7 分子质量测定

使用质谱仪在电喷雾离子源正离子模式下，采集2’-FL标准品和重组菌发酵样品的高分辨率一级质谱图，分析其分子质量。

1.4 数据处理

所有实验均设置3 次平行。采用SPSS 20.0软件，通过单因素方差分析评估差异显著性，然后使用Tukey检验进行多重比较，P＜0.05，差异显著，采用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 2’-FL合成通路的构建

由于岩藻糖价格高昂，在大肠杆菌体中通过补救合成2’-FL受到了制约。因此，采用应用前景更为广泛的从头合成途径合成2’-FL。将合成GDP-L-岩藻糖的基因manB、manC、gmd、fcI构建到质粒pETDuet-1上得到质粒pETDuet-BCGF（图1A），再将α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC构建到质粒pCDFDuet-1上得到质粒pCDFDuetfutC（图1B），之后将质粒pETDuet-BCGF和pCDFDuet-futC共转化到菌株BL21 Star (DE3)中得到能利用甘油和乳糖发酵生产2’-FL的菌株BS-3。该菌株发酵72 h后2’-FL摇瓶发酵产生的质量浓度为0.34 g/L。为进一步证实菌株BS-3合成的产物，通过HPLC和MS对2’-FL标准品与BS-3发酵液进行了比较。由图2可知，BS-3发酵液中的产物与2’-FL标准品特征一致，说明本研究构建的重组菌BS-3能够合成2’-FL。

图1 2’-FL生物合成质粒pETDuet-BCGF（A）和pCDFDuet-futC（B）的构建Fig. 1 Construction of plasmids pETDuet-BCGF (A) and pCDFDuetfutC (B) for 2’-FL biosynthesis

图2 2’-FL标准品和菌株BS-3发酵液的HPLC（A）和MS（B）谱图Fig. 2 HPLC chromatograms (A) and mass spectra (B) of 2’-FL standard and fermentation broth of strain BS-3

2.2 lacZ M15和wcaJ基因敲除对大肠杆菌合成2’-FL的影响

图3 lacZ M15和wcaJ基因敲除后重组菌2’-FL的合成分析Fig. 3 Analysis of 2’-FL synthesis of recombinant E. coli deficient in lacZ M15 and wcaJ genes

由图3A可知，lacZM15未敲除片段的PCR产物为320 bp，而敲除该片段的PCR产物为227 bp，该PCR产物测序鉴定碱基正确，lacZM15片段缺失的菌株BS-1（大肠杆菌BL Star (DE3)lacZΔM15）构建成功。同理，由图3B可知，wcaJ基因缺失的菌株BS-2（大肠杆菌BL Star (DE3)lacZΔM15ΔwcaJ）构建成功。由图3C可知，lacZM15和基因wcaJ被敲除后，重组菌2’-FL的产量明显提高，其中BS-4发酵产生0.83 g/L的2’-FL；菌株BS-5的2’-FL合成能力进一步提高，达到1.26 g/L，合成2’-FL质量浓度是BS-3的3.71 倍。

2.3 通路配置对大肠杆菌合成2’-FL的影响

进一步研究通路配置对2’-FL合成的影响，并比较了基因簇（gene cluster）形式下2’-FL的合成能力，manB-manC和gmd-fcI基因簇为大肠杆菌MG1655中的基因簇（图4A）。摇瓶发酵结果表明：目的基因组织成不同形式对2’-FL质量浓度影响较大，其中BS-7菌株（操纵子形式）产生的2’-FL质量浓度最高，为1.92 g/L；BS-8菌株（假操纵子形式）产生的2’-FL质量浓度最低，为0.39 g/L；与BS-5菌株相比较，BS-7菌株的产量提高了53%（图4B）。在这4种组织形式中，基因簇形式的基因表达强度适中，假操纵子形式的基因表达强度最高，其次是单顺反子形式，最后是操纵子形式。结果表明2’-FL的合成效率与基因表达强度呈负相关，即基因表达强度越高，2’-FL质量浓度越低。

图4 不同通路配置的重组菌2’-FL的合成分析Fig. 4 Analysis of 2’-FL synthesis of recombinant E. coli with different pathway configurations

2.4 分批补料发酵合成2’-FL分析

由图5可知，BS-7菌株分批补料发酵37 h时，菌株生物量达到最高，DCW为37.44 g/L；同时2’-FL质量浓度也达到了最高，为14.04 g/L，是摇瓶发酵质量浓度的7.31 倍，2’-FL产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%（表2）。

图5 BS-7菌株分批补料发酵合成2’-FLFig. 5 2’-FL synthesis by strain BS-7 in fed-batch fermentation

表2 BS-7菌株2’-FL的合成能力与代表性研究的比较Table 2 Comparison of 2’-FL production capacity of BS-9 with recent studies

3 讨 论

许多研究报道采取多种调控措施提高重组大肠杆菌2’-FL的产量，包括增加胞内乳糖和GDP-L-岩藻糖的可利用性，减少中间产物的代谢，增加关键酶α-1,2-岩藻糖基转移酶的可溶性表达，增加胞内GTP和NADPH辅因子的供应，调节合成通路中基因的表达水平等[9-12,27]。本研究通过在大肠杆菌中建立2’-FL从头合成途径，敲除乳糖和GDP-L-岩藻糖代谢的关键基因，并采用不同通路配置调控合成途径基因的表达水平，成功构建了具有一定应用潜力的2’-FL合成菌株BS-7。

大肠杆菌内源性的β-半乳糖苷酶会消耗摄入的乳糖，敲除lacZ基因能提高乳糖的利用率从而增加2’-FL的合成[28]。研究表明缺失该基因功能性片段M15肽段的大肠杆菌BL21 (DE3)β-半乳糖苷酶活性降低了97%[28]。此外，合成2’-FL的供体GDP-L-岩藻糖在大肠杆菌中可用于合成荚膜异多糖酸，尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶是该合成途径中的第一个酶[10]。敲除lacZM15和wcaJ后，阻断了乳糖的代谢，同时也合成了更多的GDP-L-岩藻糖，利于产物2’-FL的不断积累，因此产生的2’-FL质量浓度从0.34 g/L提升到1.26 g/L（图3）。

微生物合成天然或非天然产物通常涉及引入多个编码代谢途径酶的基因，一般情况下这些基因应以适当的水平表达，以避免有毒中间体的积累或生长被抑制的问题[29]。本研究中，从头合成途径基因组织在操纵子形式下大肠杆菌BS-7产生的2’-FL质量浓度最高，而在假操纵子形式下产生的2’-FL质量浓度最低，即重组菌产生2’-FL的质量浓度与合成途径中的基因表达强度呈负相关（图4）。大肠杆菌中GDP-L-岩藻糖合成途径的基因较低水平表达，α-1,2-岩藻糖基转移酶较高水平表达能显著增加2’-FL产量[12]。在操纵子形式下，通路中各基因处在较低的表达水平，GDP-L-岩藻糖合成途径的基因表达水平与α-1,2-岩藻糖基转移酶的表达水平能达到较为平衡的状态，因此能提高2’-FL产量。而在假操纵子形式和单顺子形式中，各基因的表达水平显著提高，GDP-L-岩藻糖合成途径的基因表达水平与α-1,2-岩藻糖基转移酶表达水平失衡，导致2’-FL产量下降。

提高重组菌2’-FL产量、使用廉价发酵原料、增加底物转化效率是推动2’-FL工业化应用的关键点[5]。与补救途径使用岩藻糖和乳糖作为底物相比，从头合成途径只需乳糖作为底物便可生产2’-FL，其具有更高的经济性[5]。甘油价格低廉，不会存在细胞生长和产物合成过程中代谢物抑制的情况，因此甘油已被广泛应用于2’-FL和3-岩藻糖基乳糖的合成[30]。本研究得到的重组菌BS-7采用从头合成途径，使用甘油作为碳源。BS-7在10 L发酵罐中产生的2’-FL质量浓度最高，为14.04 g/L（图5），产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%（表2）。与已发表文献对比后发现BS-7的乳糖转化率处于较高水平，产率也处在中等水平（表2），该菌株在工业化应用具有较高的潜力。

4 结 论

基于通路配置构建了能高效合成2′-FL的大肠杆菌重组菌BS-7，以操纵子形式表达从头合成途径的基因manB、manC、gmd、fuI和futC时产生的2′-FL质量浓度显著提高，其乳糖转化率和2′-FL产率处于较高的水平，显现出较好的应用潜力，为大肠杆菌高产2′-FL微生物细胞工厂构建和生物合成提供一定理论依据。