BerEp4联合弹性纤维双重染色在肺腺癌累及胸膜组织的临床应用

蒋汉文*，赖肖芬，陈水莲，万里燕，张小鹰，郭明星

（1广州市番禺区妇幼保健院病理科，广州 511402；2广州市番禺区中心医院病理科，广州 511400）

在诊断肺叶切除术及楔形切除术的肺癌病理标本中，不仅要在报告中注明肺腺癌组织有无累及脏层胸膜，如出现累及情况还需要明确肿瘤组织侵犯的层次。由于肿瘤组织发生脏层胸膜侵犯时，肿瘤细胞在胸腔内播散概率会随浸润层次加深而递增，肿瘤不再局限于肺内，会形成肿瘤性胸水，患者预后更差，因此，肿瘤侵犯脏层胸膜成为患者预后的重要影响因素[1]。传统的弹性纤维独立染色只能观察弹性纤维在肺组织内的分布情况，由于肿瘤组织非特异性染色，难以观察腺癌组织与脏层胸膜之间的关系，也难以排除胸膜组织内间皮增生及组织细胞聚集的干扰。目前与弹性纤维联合染色的方案有TTF-1[2]或CK-pan[3]免疫组织化学染色联合弹性纤维染色两种，但均有难以克服的缺点。

细胞黏附分子BerEp4具有广谱腺上皮特异性标记，能在广谱腺癌中表达，而且可以排除增生的间皮细胞干扰。本实验以BerEp4联合弹性纤维双重染色，为肺腺癌累及胸膜组织判读提供新的备选方案。

材料与方法

1 材料收集

收集2018年1月至2022年2月广州市番禺区妇幼保健院病理科和广州市番禺区中心医院病理科50例肺腺癌组织蜡块及相应的TTF-1免疫组织化学染色结果，其中TTF-1免疫组织化学染色阳性45例（阳性率90%）。

2 主要试剂

即用型鼠抗人BerEp4单克隆抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）；DAB染色液（增强聚合物法）试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），包含内源性过氧化物酶阻断剂、反应增强液、酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，加强型DAB缓冲液、加强型DAB底物、DAB色原等；免疫组织化学抗原修复缓冲液（胃酶法）（福州迈新生物技术开发有限公司）；维多利亚蓝弹力纤维染色液试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），包含Tanake氧化剂A、Tanake氧化剂B、Tanake漂白剂、维多利亚蓝弹力纤维染色液、核固红染色液； PBS（pH7.3）粉末（北京中杉金桥生物技术有限公司）；吐温20（天津永大）。

3 溶液配制

Tanake氧 化 剂： Tanake氧 化 剂A与25 mL Tanake氧化剂B按1:1比例混合，现配现用。

DAB显色液：配制管中加入加强型DAB缓冲液（1×）1 mL、加强型DAB底物（20×）50 µL、DAB色原（20×）50 µL，混匀，现配现用。

pH7.3 PBS：取磷酸盐粉剂 1 袋，溶于 2000 mL蒸馏水中，加入1 mL吐温20，混匀。

4 染色方案

HE染色：3 μm石蜡切片常规脱蜡至水，常规苏木素和伊红染色后梯度酒精脱水，中性树胶封固。

弹性纤维独立染色案：4 µm石蜡切片常规脱蜡至水，置于新配的Tanake氧化剂中室温氧化5 min，取出自来水稍洗；置入50 mL的Tanake漂白剂中漂白2 min，直至氧化剂的颜色全脱净后自来水冲洗5 min；用70%乙醇浸洗后置于50 mL维多利亚蓝染色液中浸染24 h（加盖）；70%乙醇快速浸洗2次，每次10 s，直至切片无颜色脱出后流水稍洗；滴加核固红染色液覆盖组织复染5 min，流水稍洗；常规脱水透明，中性树胶封固。

Ber-EP4联合弹性纤维双重染色：采用Elivison二步法，3 µm石蜡切片65 ℃烤箱中烤片1 h后常规脱蜡至水，吸水纸吸去切片上的水分，距组织边缘2~3 mm处用免疫组织化学笔画圈后于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，滴加100 μL免疫组织化学抗原修复缓冲液（胃酶法）进行抗原修复，于37℃下孵育15 min后用PBS稍冲洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，加入3%过氧化氢作用10 min阻断内源性过氧化物酶，然后用PBS稍冲洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，加入BerEP4一抗，于37 ℃孵育60 min后用PBS稍冲洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，加入反应增强液于37 ℃下孵育20 min后用PBS稍冲洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，加入酶标抗小鼠/兔IgG聚合物于37 ℃下孵育30 min后用PBS稍冲洗，再于PBS中浸洗1 min；甩去多余液体，加入DAB显色液至切片上，室温下孵育5 min，自来水终止显色，70%乙醇浸泡1 min。置于50 ml维多利亚蓝染色液中浸染24 h（加盖）；用70%乙醇快速浸洗2次，每次10 s，直至切片无颜色脱出后流水稍洗；滴加核固红染色液覆盖组织复染5 min，流水稍洗。常规脱水透明，中性树胶封固。

结 果

50例肺腺癌中，非黏液型腺癌共48例（包含原位腺癌23例、微浸润性腺癌8例、浸润性腺癌19例），黏液型腺癌2例。BerEp4联合弹性纤维双重染色阳性47例（阳性率94%）。在5例TTF-1阴性表达的肺腺癌中，BerEp4联合弹性纤维双重染色阳性4例。

50例肺腺癌与脏层胸膜关系结果分别为：未累及脏层胸膜（PL0）42例（图1A），突破脏层胸膜内弹性纤维层但未突破外弹性纤维层（PL0）3例（图1B），突破脏层胸膜外弹性纤维层但未突破间皮细胞层（PL1）3例（图1C），突破脏层胸膜间皮细胞层（PL2）2例（图1D），脏层胸膜局灶间皮细胞增生及组织细胞聚集（胸膜反应）（pleural reaction， PLR）1例（图1E）。

讨 论

BerEp4作为一种广谱的腺上皮标记物，除肝细胞与胃壁细胞以外，均能表达于所有腺上皮，在间皮细胞与鳞状上皮细胞中呈阴性表达。由于BerEp4用于腺癌诊断具有较高的特异性和敏感性[4-6]，因此常常应用于胸腔积液中查找腺癌细胞[7]，是一种理想的抗体。同理，在肺腺癌的手术标本中阳性表达时，则可排除组织细胞聚集、恶性间皮瘤、间皮细胞增生及鳞状细胞癌等病变。与弹性纤维联合染色能更清晰地观察肿瘤细胞与脏层胸膜之间的关系，特别是微小癌组织累及脏层胸膜的情况。在双重染色中，腺癌细胞被染成黄棕色，脏层胸膜的弹性纤维被维多利亚蓝[8]染成蓝色，而背景组织被染成红色。这种染色方案不仅能增加肿瘤组织与肿瘤周围组织的对比度，还提高了诊断的可靠性。

与TTF-1及CK-pan免疫组织化学染色联合弹性纤维染色方案相同，BerEp4联合弹性纤维双重染色方案能解决诊断工作中的以下问题：一是协助判读腺癌组织有无累及脏层胸膜以及浸润深度。双重染色能区分好肿瘤组织与脏层胸膜的4种关系（PL分期）：① 肿瘤未累及脏层胸膜，肿瘤细胞位于内弹性纤维层下方并没有突破（PL0）（图1A1）。②肿瘤突破脏层胸膜内弹性纤维层，但未突破外弹性纤维层（PL0）（图1B1）。③肿瘤突破外弹性纤维层，但未突破间皮细胞层（PL1）（图1C1）。④肿瘤突破间皮细胞层（PL2）（图1D1）。在独立染色的情况下，往往需要病理医师反复切换HE及弹性纤维切片（图1A2、B2、C2、D2）。而双重染色能更清晰观察腺癌与脏层胸膜的关系（图1A3、B3、C3、D3）。二是协助鉴别原位腺癌与附壁生长型浸润性肺腺癌（胸膜侵犯为附壁生长型浸润性肺腺癌的充分条件）。对于附壁生长方式的肺腺癌，病理医师需要仔细查找有无脏层胸膜累及。当出现累及时，患者预后变差，病理诊断会从原位腺癌直接跃升为附壁生长型浸润性肺腺癌。pTNM分期也直接从原位腺癌的Tis期调整为附壁生长型浸润性腺癌的T2期[9]，患者的预后及治疗方案同时会发生明显改变。可靠的脏层胸膜评估显得十分重要。三是当组织细胞在脏层胸膜下聚集时（图1E1），组织细胞形态可呈圆形或多边形，特别细胞核增大时和肿瘤细胞相似，难以区分，双重染色（图1E3）有助于排除组织细胞聚集导致的假阳性情况。四是肺内碳尘堆积的情况十分常见，在HE染色（图1B1）及弹性纤维染色（图1B2）的切片中会覆盖腺癌组织，难以观察。而且碳尘颜色与DAB试剂显色相似，在免疫组织化学单独染色的切片上难以区分，影响判读。但经过弹性纤维染色后，碳尘被染成黑色，与双重染色的棕褐色有明显的区别（图1B3）,有利于解决因碳尘淤积的漏诊情况。

相比CK-pan，BerEp4免疫组织化学染色能排除以下的假阳性情况：①脏层胸膜间皮细胞反应性增生可继发于肺部感染、非特异性炎症或肿瘤刺激[10、11]。此时间皮细胞可表现为数量丰富， 形态异型，甚至出现核分裂或发生坏死等，难与肿瘤性病变互相鉴别[12]。因为腺癌及间皮细胞能共同表达CK-pan，导致难以鉴别脏层胸膜上CK-pan阳性的细胞是由于腺癌累及还是间皮细胞团内陷或反应性增生所造成。②由于组织细胞具有吞噬坏死细胞的能力，如果组织细胞内的吞噬包涵体含有细胞角蛋白的细胞碎片（如间皮细胞碎片），导致组织细胞阳性表达CK-pan[13,14]，可能会误诊为脏层胸膜侵犯。虽然未曾在胸膜组织中报道过相关个案，但这种现象仍让人不安。③少数非上皮细胞（如:肌纤维母细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞）在某个分化阶段过程中也能表达CK-pan。而相比TTF-1，BerEp4能广谱表达于各种类型肺腺癌中。10%～20% 的肺腺癌TTF-1呈阴性表达[15]，由于肺腺癌患者总数非常庞大，意味不少原发性肺腺癌病例，如胶样腺癌、黏液腺癌、肠型腺癌及涎腺型腺癌等未能获益于TTF-1方案，而BerEp4有助于解决部分TTF-1阴性的腺癌病例，能成为TTF-1阴性情况的补充方案。另外，部分实性形态的癌因不表达TTF-1、napsin A、p40、p63及CK5/6，当黏液染色未能发现含黏液细胞时，将会被诊断为肺大细胞癌。而BerEp4可能会成为鉴别TTF-1阴性的实体型肺腺癌与非角化性鳞状细胞癌的潜在标记物。

BerEp4免疫组织化学方案具有以下缺点：①由于BerEp4表达谱较广，对于转移性腺癌也会出现阳性表达的可能。但大部分肺腺癌具有特征性的生长方式，与转移性腺癌不同，而且可结合临床及影像学提供的资料排除转移性腺癌。②BerEp4方案对制片技术要求较高，修复时需要滴加胃酶进行修复，这个过程必须要把温度、浓度及时间控制得十分精准，无疑增加了BerEp4染色的不稳定性。因此在众多实验室中的数据差异性大，容易出现假阴性可能，有时候需要重复实验才能获得较为满意的效果。

随着病理技术进步和病理诊断精细化，双重方案有助于减少病理诊断的疑难，成为病理诊断的发展方向。BerEp4免疫组织化学方案弥补了TTF-1及CK-pan免疫组织化学方案的局限性，成为肺腺癌双重染色方案的重要补充。