DNA甲基化在甲状腺癌中的作用及机制研究进展

赵柯郁，苏秀兰*

（内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，内蒙古医学细胞生物学重点实验室，呼和浩特 010050）

甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤之一，过去30年间，甲状腺癌发病在世界范围内呈逐年递增趋势[1]。根据全球癌症报告（2018年）数据显示，2018年全球甲状腺癌新增病例56万例，死亡4万例，排名癌症发病第九位[2]。甲状腺癌发生有多种机制参与，其中遗传学变化是重要原因之一，包括基因突变及基因重排等，常见的如BRAF（B-Raf proto-oncogene, serine/threonine kinase）、RAS基因突变，RET/PTC重排。还有近年研究较多的如端粒酶逆转录酶（telomerase Reverse transcriptase，TERT），其启动子突变在在侵袭性和未分化肿瘤中广泛存在，目前已作为生物学指标在临床应用[3-6]。除基因本身改变，遗传学变化的重要组成部分-表观遗传学，也在甲状腺癌中发挥着重要作用，表观遗传修饰包括多种类型如DNA甲基化、m6A以及组蛋白修饰等，其中DNA甲基化是第一个被发现也是研究最广泛的表观遗传学修饰[7]。随着研究深入，DNA甲基化在甲状腺癌中的作用和机制逐渐被阐明，下文将就最近几年甲状腺癌与DNA甲基化相关领域的研究成果，对DNA甲基化在甲状腺癌中的功能与机制以及筛查与应用进行详述。

1 DNA甲基化及其在甲状腺癌中的作用

DNA甲基化由DNA甲基化酶（DNA methyltransferases，Dnmts）家族催化，将一个甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenyl methionine, SAM）转移到DNA胞嘧啶5号位碳端，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），通常发生在CpG二核苷酸位点[8,9]。DNA甲基化在基因表达调控、遗传印迹以及X染色体失活等细胞过程中具有关键作用[10]。研究表明，DNA甲基化状态与甲状腺癌发生发展密切相关，如RAP1 GTP酶激活蛋白（RAP1 GTPase activating protein，RAP-1GAP），Ras激活物类似物1（RAS activator like 1，RASAL1）, REC8以及Ras关联域蛋白1（Ras association domain family member 1，RASSF1）等多个抑癌基因启动子甲基化水平升高，NOTCH4、MAP17以及 TCL1B等基因甲基化水平降低[11-14]。另外，与甲状腺功能相关基因促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor, TSHR）基因和，NK2同源盒1（NK2 homeobox 1, NKX2-1）基因，也发现在甲状腺癌中高度甲基化[15,16]。Ceolin等[17]对42名患者进行了总体DNA甲基化水平对比研究，发现髓样甲状腺癌（medullary thyroid cancer，MTC）患者相比甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者拥有更高的DNA甲基化水平，表明不同甲状腺癌类型具有不同DNA甲基化水平，未来或可利用其进行分型。Qu等[16]通过对14个研究的914例样本进行了Meta分析，发现在PTC中TSHR甲基化水平更高且与PTC发病相关。可见DNA甲基化可以通过影响相关基因表达，促进甲状腺癌发生发展。在临床应用方面，DNA甲基化具有作为诊断筛查标记物以及治疗靶点的潜力[18]。

2 DNA甲基化与甲状腺癌信号通路

DNA甲基化在甲状腺癌信号通路调控中发挥重要的作用，DNA甲基化会影响信号通路相关调控基因的表达从而调节信号通路活性。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路以及磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信号通路是目前研究发现与甲状腺癌相关的两条主要信号通路，在调控甲状腺癌细胞生长、分化、转移和生存中具有重要作用。Lee等[19]发现，MAPK通路抑制基因丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶分化枝A成员5（serpin peptidase inhibitor A member 5 ，SERPINA5）在甲状腺癌中由于甲基化导致表达水平降低[20]，提示其可能是导致MAPK通路异常的重要因素之一。甲状腺癌中PI3K通路可由于AKT1、PIK3CA以及Ras突变，双链复合蛋白8/过氧化物酶体增殖物激活受体（paired box 8/peroxisome proliferator-activated receptor，PAX8/PPAR）重排等被异常激活[21]。Alvarez-Nunez[22]及Hou[23]等先后发现在多种甲状腺癌，特别是在甲状腺滤泡状癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）和未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）中，抑癌基因磷酸酯酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）会发生异常甲基化而表达下降，并最终作用于PI3K/Akt信号通路。Wang等[24]在PTC组织和细胞系的研究中发现T-box转录因子家族的TBX1基因启动子甲基化水平显著升高。甲状腺癌细胞系中通过去甲基化重新活化的TBX1基因靶向PI3K/AKT以及MAPK/ERK通路调控基因A激酶锚定蛋白12（A-kinase anchoring protein 12 ，AKAP12），环指蛋白41（ring finger protein 41，RNF41），ABI家族成员3结合蛋白（ABI family member 3 binding protein，ABI3BP）等，从而降低PI3K/AKT以及MAPK/ERK通路活性，抑制甲状腺癌细胞生长、诱导凋亡、抑制癌细胞的迁移侵袭和上皮间质转化（EMT）。此外，Ravi等[25]对ATC和正常组织的RNA表达以及85万个CpG位点甲基化水平进行了检测，发现启动子低甲基化且表达升高的基因191个，基因体（gene body）DNA甲基化升高且表达升高的基因32个（基因体DNA高甲基化与基因表达升高相关[26]），基因体低甲基化且表达下降的基因226个，此外还发现9390个增强子区域低甲基化CpG岛与邻近基因高表达相关。基因通路主要富集于细胞粘附、激酶和细胞周期。其中最显著的包括致癌基因雷帕霉素机能靶位点（mechanistic target of rapamycin，mTOR）以及神经源性基因Notch同源蛋白1 靶点（neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1）。其中mTOR主要通过PI3K/AKT/mTOR通路促进甲状腺癌发生发展并具有作为治疗靶点的潜力[6,27]。

除MAPK和PI3K通路外，p53和Wnt/β‐catenin通路在甲状腺低分化癌和未分化癌中发挥重要作用。White等[28]对PTC的DNA甲基化研究，分析与疾病相关通路时发现wnt/β‐catenin和p53与PTC发生发展显著相关。Hippo信号通路是包括甲状腺癌在内的多种癌症的关键调控因子，在Peng[29]的研究中，lncRNA TNRC6C-AS1通过提高Hippo信号通路关键蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4（serine/threonine‐protein kinase 4，SKT4）启动子甲基化水平导致其表达降低，进而通过活化Hippo信号通路促进甲状腺癌的发展。

3 DNA甲基化与甲状腺癌基因突变

基因突变是引起甲状腺癌的重要原因之一，在PTC中，致癌基因BRAFV-600E突变会驱动Ras/Raf/MEK/ERK（MAPK）信号通路，RAS基因突变、RET/PTC、TRK基因融合等也均会引起MAPK通路激活，促进甲状腺癌发生[30-32]。Hu等发现在BRAF突变型PTC中，基质金属蛋白酶组织抑制因子-3（tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3）, 溶质载体家族5成员8（solute carrier family 5 member 8，SLC5A8），死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）以及视黄酸受体β2（retinoic acid receptor β2，RARβ2）甲基化水平升高[33]。Zhang等发现DAPK1和RASSF1A基因甲基化与BRAFV-600E突变显著相关[34]。此外，基质金属蛋白酶2（matrix metallopeptidase 2，MMP-2）、Ras家族基因以及磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）等同样发现与BRAF突变相关[35]。髓样细胞表达触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）基因是Xie等[36]通过生物信息学方法发现的基因，通过分析发现其与不良预后、T分级和N分级相关，并增加BRAF突变情况下甲状腺癌的发病率，且具有作为诊断标记物的潜力，而其具体的功能和实际应用潜力，还需要实验验证。以上研究表明基因突变与DNA甲基化具有密切关联，目前有研究结合突变与DNA甲基化进行精确诊断和治疗，然而突变基因引起甲基化异常的机制，尚待阐明。

4 DNA甲基化与甲状腺癌的筛查和诊断

甲状腺癌精确诊断是目前临床挑战之一，包括甲状腺结节良恶性判断以及甲状腺癌分类等。所以迫切需要一种可靠、实用的标记物对甲状腺癌进行诊断。DNA甲基化作为潜在标记物，已在多种癌症中进行了研究，在甲状腺癌中亦有报道[37]。Stephen等通过对329名患者进行DNA甲基化分析来区分FTC/PTC以及良性甲状腺结节，可利用TPO和UCHL1基因区分FTC和滤泡腺瘤（FA（follicular adenomas, FA），RASSF1和TPO区 分FTC和 正常，TSHR区分PTC和FTC，TIMP3, SERPINB5和TSHR等区分PTC和正常甲状腺。Park等[38]同样从DNA甲基化入手探索新的诊断生物标记物，发现cg10705422, cg17707274和cg26849382三个位点用以区分分化型非恶性肿瘤和分化型甲状腺癌。除了对标记物的筛选，研究人员还开发出了基于DNA甲基化的诊断方法。Barros-Filho等[39]基于全基因组甲基化测序和TCGA数据库数据，选取5个CpG位点建立甲状腺癌诊断模型，对于良性和恶性肿瘤区分可以达到82.4%的特异性。Yim等[40]开发一种新的表观遗传学分析方法Diagnostic DNA Methylation Signature (DDMS），以DNA甲基化作为对甲状腺结节诊断的标准，特异性可以达到97%，将诊断准确性进一步提升。可见利用DNA甲基化对甲状腺癌进行直接或辅助诊断，具有较高的特异性和敏感性，和较大的应用潜力。

5 总结与展望

本文从基因组DNA甲基化、DNA甲基化对信号通路的影响、基因突变与DNA甲基化的关联以及在诊断和治疗中的应用几个方面进行了阐述。甲状腺癌中基因组DNA甲基化往往会发生变化，此外基因突变与DNA甲基化密切相关。甲状腺癌中甲基化水平的变化会影响多种通路的活性，且存在多种表观修饰共同作用，例如LINC00313可募集DNMT1和DNMT3B促进ALX4基因启动子区域甲基化，激活AKT/mTOR信号通路促进甲状腺癌发展[41]。目前研究大多仍处于单基因甲基化影响，其明确的功能、完整的调控网络和机制尚待深入研究，基因突变与甲基化之间的关联机制也有待详述，与其他表观遗传学之间的共同作用也需深入研究。另外重要的是，DNA甲基化具有诊断标记物的潜力，可作为精准诊断的依据。随着技术的进步，DNA甲基化与其他多组学检测结合可能将会成为未来诊断和治疗的发展方向。