宏基因组测序技术在结核性脑膜炎诊断中的应用研究进展

石亚玮，李鑫，武国德，石正洪

兰州大学第二医院神经内科，兰州 730000

近年，结核病的发病率和病死率仍较高。除了肺结核，结核分支杆菌复合群（Mycobacterium tuber‐culosis complex，MTBC）可感染肺外组织，导致肺外结核（extrapulmonary tuberculosis，EPTB）。结核性脑膜炎（Tuberculous meningitis，TBM）是最严重的一种EPTB，是目前结核病致残或致死的主要原因［1］。TBM 占肺外结核的6.8%［2］。TBM 好发于儿童和免疫缺陷人群，但TBM 的传染性低于活动性肺结核。因为早期明确诊断困难，TBM 患者的预后较差，治疗后常存在严重的神经功能缺损症状，病死率较高（成人50%，儿童20%）［1，3］。早期明确TBM 诊断，及时有效对症治疗是改善预后的关键。传统的病原学检测方法在结核病的诊断中均存在一定局限性。宏基因组二代测序（metagenomicNextGenerationSe‐quencing，mNGS）技术不依赖于传统微生物培养，可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，在基因水平快速地检测病原体，理论上可检测出样本中的所有病原体，适用于危急重症和疑难感染的诊断。mNGS 的出现或许为TBM 的诊断提供了新思路。现就mNGS在结核性脑膜炎诊断中应用的相关研究进展综述如下。

1 临床常用TBM诊断方法的优缺点

1.1 脑脊液结核分枝杆菌检测方法 是在细菌层面进行结合分枝杆菌病原体检测，目前临床常用TBM的细菌学检测方法有脑脊液涂片AF染色和结核分枝杆菌培养。目前国际上公认的TBM的诊断标准主要参照2010年由MARAIS 等［4］制定的复合标准。

脑脊液抗酸（Acid-Fast，AF）染色，也称为Ziehl-Neelsen 染色，是目前临床广泛应用的结核分枝杆菌诊断方法，可作为明确诊断结核的第一步。不同于革兰氏阳性杆菌和格革兰氏阴性细菌，结核分枝杆菌具有独特的细胞壁结构，对革兰氏染色具有抵抗力，细胞壁能够耐酸性酒精脱色，这是结核分枝杆菌抗酸性的来源。脑脊液涂片AF 染色检测结果为结核分枝杆菌阳性可明确诊断为TBM。但AF 染色方法要求每毫升脑脊液中结核分枝杆菌载量在5 000～10 000 以上，但结核分枝杆菌作为一种胞内菌，在脑脊液中的病原体载量很低，导致脑脊液涂片AF 染色诊断TBM 的阳性率只有10%～20%［3］。目前有多种改良染色方法在一定程度上提高了脑脊液涂片AF 染色诊断TBM 的灵敏度，但其检出率仍然达不到临床应用要求。

结核分枝杆菌培养是目前临床诊断TBM 的金标准，诊断结核分枝杆菌的灵敏度较高（50%～60%）。结核分枝杆菌培养主要有液体培养法和固体培养法两种。但两种培养方法所需时间均较长，往往会延误患者的病情诊治时间，在TBM 早期诊断中的临床应用价值有限［5］。

1.2 结核分枝杆菌分子生物学检测方法 即扩增结核分支杆菌的遗传物质，目前临床常用TBM的分子生物学检测方法有聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测（Xpert MTB/RIF）技术和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification LAMP）等，mNGS检测也属于分子生物学检测技术中的一种。

PCR 是一种体外核酸扩增技术，可提取和扩增临床标本中的遗传物质。PCR诊断结核分枝杆菌的灵敏度（55.8%～87.6%）［6］及特异度（94%～100%）［7］均较高，且诊断所需时间短，目前已用于TBM 的诊断中。但脑脊液中结核分枝杆菌的载量低限制了PCR的广泛应用。

Xpert MTB/RIF 技术和LAMP 技术都是新型核酸扩增技术（nucleic acid amplification tests ，NAATs），检测所需时间较短，目前已逐渐应用于TBM 的早期诊断中。2013 年世界卫生组织（WHO）推荐将Xpert MTB/RIF 技术作为TBM 诊断的首选初始检测方法，但Xpert MTB/RIF 技术对脑脊液样本的要求高，包括脑脊液的样本量以及细菌负载量等，都在一定程度上限制了其在临床工作中的应用。

1.3 结核分枝杆菌免疫学检测方法 结核分枝杆菌可致患者体内产生特异性抗原，刺激T 淋巴细胞分泌γ 干扰素。γ-干扰素释放试验（interferon-gam‐ma release assays，IGRAs）可通过检测γ 干扰素，判断是否存在结核分枝杆菌感染［8］。腺苷脱氨酶（Ad‐enosine deaminase，ADA）检测和阿拉伯糖甘露糖脂（Lipoarabinomannan，LAM）检测均是基于免疫学的检测方法，但目前临床应用较少，其对结核分枝杆菌的诊断效能也较差。

TBM 明确诊断困难的原因主要有：①TBM 的临床症状以及脑脊液检查、影像学检查等各种辅助检查结果，都与病毒性脑膜炎、隐球菌性脑膜炎（Cryp‐tococcus Neoformans Meningitis，CNM）等中枢神经系统感染性疾病相似［9］。甚至，患者可出现TBM、隐球菌性脑膜炎的双重感染，增加确诊难度［10］。②脑脊液标本需通过腰椎穿刺有创操作获取，导致部分患者明确诊断困难。同时，结核分枝杆菌的生长需要高浓度的氧气，且生长速度特别慢，而脑脊液是一种相对无菌的体液，导致脑脊液中结核菌的载量非常低［11］。③多数TBM 由结核分枝杆菌引起，但部分病例为牛分枝杆菌等非结核分枝杆菌病原体致病［12］。④TBM 的临床症状不典型，部分患者在未明确诊断的时候已进行试验性治疗［13］。

2 mNGS在TBM诊断中的应用

2.1 mNGS在TBM诊断中的优势及局限性

2.1.1 mNGS在TBM诊断中的优势

2.1.1.1 无偏倚检测 mNGS 可对目前所有已知的病原微生物（病毒、细菌、真菌及寄生虫）总DNA或RNA 进行无偏倚和全覆盖的检测［14］，可用于临床表现不典型的TBM、混合感染以及临床中难以确诊但高度怀疑神经系统感染的病例中。TBM 有时会同时合并其他病原体感染，而mNGS 的无偏倚检测的特性能够在检测结核分枝杆菌的同时，检出病毒、隐球菌、其他不常见细菌等病原体。一项关于mNGS 在AIDS 患者疑诊中枢神经系统感染的研究［15］中发现，在一例检测前初步诊断为TBM 的患者中，最终发现合并曲霉菌感染。此外，除结核分枝杆菌外，牛结核分支杆菌等其他结核分枝杆菌属病原体也可引起TBM［16］。国内也有相关的报道，张芙蓉等［17］采用mNGS 诊断了1 例合并血管炎的TBM。钱乔乔等［18］用mNGS诊断一般检测手段难以确诊的儿童TBM 5例。

2.1.1.2 诊断灵敏度高 脑脊液中结核分枝杆菌的负荷量通常较低，限制了其他检测方法的应用，而mNGS的高灵敏度是显著区别于其他检测手段的优势。一项关于mNGS在TBM诊断中的可行性分析研究［19］中，共纳入23例（12例明确诊断，11例临床诊断）患者，最终mNGS 检测结果为18 例结核分枝杆菌阳性，mNGS 诊断TBM 的灵敏度78.26%、特异度100%，与传统检测方法结合后检出率提高到95.65%。一项前瞻性多中心研究［20］对213 例中枢神经系统感染性疾病中拟诊为TBM 的44 例（6 例明确，38 例可能）患者进行研究，发现脑脊液Xpert MTB/RIF 阳性率为16.13%（5/31），mNGS 阳性率为27.27%（12/44）；mNGS和Xpert MTB/RIF联合阳性率为29.55%（13/44），且所有脑脊液样本的抗酸染色和结核分枝杆菌培养结果均为阴性，但是Xpert MTB/RIF技术和mNGS检测的一致性有待进一步研究。最新一项前瞻性研究［21］显示，mNGS 诊断疑似TBM的敏感度58.8%（20/34）、特异度为100%（16/16），而确诊患者中，mNGS 诊断的敏感度为63.6%（14/22），传统检测方法联合mNGS诊断TBM的敏感度高达82.4%（28/34）。一项研究［22］共纳入肺外标本结核分枝杆菌涂片染色阴性的疑似患者208 例，结果mNGS 检测结果阳性45 例；在各种肺外结核中mNGS 检测TBM 的阳性率最高；AUC 值是各种检测方法中最高（0.79）；其中33 例患者mNGS 检测阳性而其他检测（包括细菌培养和Xpert MTB/RIF 技术）检测阴性。抗酸染色检测阳性说明结合分枝杆菌的病原体载量高，在抗酸染色涂片阴性的患者检出结核分枝杆菌阳性，说明mNGS 诊断结核分枝杆菌灵敏度较高。总之，mNGS 对TBM 的诊断价值较高，且mNGS 联合其他检测方法能够提高其诊断效能。

2.1.1.3 检测周期短 mNGS检测周期为2～3天，与细菌培养相比，明显缩短了临床诊断时间。一项研究［26］中对结核分支杆菌培养、Xpert MTB/RIF 以及mNGS 技术所需要的时间进行了对比，Xpert MTB/RIF检测所需时间平均为2 h，而结核杆菌培养需要时间为2～3周，培养结果为阴性的甚至需要更长的时间，一般在2个月左右。

2.1.1.4 检测结果不受抗结核药物等的影响 传统检测手段多依赖于标本中活菌的存在，所以检出率在使用抗结核药物的情况下有一定程度的降低。YAN 等［23］共纳入51 例HIV 阴性患者，其中45 例被诊断为TBM（38 例明确、5 例很可能及2 例可能），6例为非TBM，以最终诊断为参考标准，脑脊液mNGS检查对TBM 诊断敏感度、特异度分别为84.44%（38/45，69.94%～93.01%）、100%（6/6，51.68%～100%），mNGS的诊断敏感度（84.4%）明显高于抗酸染色检查、细菌培养（22.2%，P= 0.000）、PCR（24.4%，P= 0.000）和Xpert MTB/RIF 技术（40%，P= 0.000）。该研究结果发现，检测前是否使用抗结核药物对mNGS的检测结果没有影响。其将患者分为检测前进行过抗结核药物治疗组和未进行抗结核药物治疗组，结果显示两组mNGS 阳性结果分别为51 例（52.94%）与129 例（62.79%），两组检出率之间无统计学差异。并与其他检测方法进行了比较，结果发现进行细菌培养的抗结核药物治疗组的阳性结果有0 例，未进行抗结核药物治疗的有25 例（19.51%）；进行Xpert MTB/RIF 的抗结核药物组的阳性结果有12 例（23.53%），未进行抗结核药物治疗组的有54例（41.86%）。

临床目前对mNGS对TBM的诊断效能尚存在一定争议。可能原因为：①纳入标准不同，有些研究以疑诊TBM 为标准，有些研究以其他检测方法确定诊断的TBM 为标准；②研究对象不同，有些研究选取HIV 阴性的病例，有些是将AIDS 病人涵盖其中的，而AIDS 患者作为TBM 的高发人群，纳入范围广的在一定程度上降低了检出率；有些研究是在综合医院选取研究对象，有些则是从结核病专科医院进行；③最终诊断标准不同，多数研究的诊断标准为CRS（composite reference standard），但也有例外，比如有些研究并未将抗结核治疗效果的评价作为诊断的参考，此外，大多数研究对于mNGS的检测结果没有进行进一步的验证（PCR），直接将mNGS 检出结核分支杆菌的病例认为是TBM；④研究样本量较小等。

2.1.2 mNGS 在TBM 诊断中的局限性 ①背景菌或污染问题：污染微生物序列是脑脊液检测的主要问题。由于mNGS 技术高度的灵敏度，很容易检出无关的来自外界环境或者试剂的微生物，有时甚至难以与责任病原体区分；同时，宿主来源的遗传物质或人体正常寄生菌也会在测序过程中被检出，导致真正的病原体序列所占比例往往很小。在非常低生物量的样本（如CSF）中，测序试剂的污染物就会发生过度扩增。当CSF 样本中几乎不存在生物量时，PCR扩增步骤中使用的引物会一次又一次地放大环境污染物的最小数量，从而增加最终数据集中污染物的比例代表性。mNGS 检出率最高的污染菌是Propionibacterium acnes，Acidovorax KKS102 和拟短杆菌（Brevundimonas subvibri-oides）［23］。②病原学数据库不完善：mNGS 技术虽然可以无差别地将样本中的所有遗传物质检测出来，但是最终结果是将特异性DNA 或RNA 片段在病原学数据库中进行对比而得出的，只有所选数据库中包含已知生物的同源性序列才能被识别。所以，在mNGS 检测结果为阴性时，并不能完全排除是某一新病原体导致的感染的可能性。③测序成本高：测序所需实验室条件要求高，一般的实验室不具备操作条件，高通量测序技术产生非常大的数据集，例如，基于Illumina的mNGS 旨在为每个样本生成5～2 000 万个100～150 nt 核苷酸序列，处理这些海量数据需要的很强的技术支持。④操作要求严格：包括标本的获取、运输、保存等各个步骤，稍有不慎，都将对测序结果产生影响，例如若在进行检测之前CSF 样本就已经在室温下储存或冷藏多天，病原体的核酸（尤其是RNA）可能已经降解，mNGS 可能产生假阴性结果。⑤检测结果解读程度不一：mNGS 无法判断所检出的病原体是否正在生长或复制，如有时可以在脑脊液中检出EB 病毒，但EB 病毒可能只是潜伏在脑脊液中的病原体而非此次发病的责任病原体，此时对于检测结果的解读需要慎重。

2.2 如何提高mNGS 在TBM 中的诊断效能 为提高结合分枝杆菌的检出率，mNGS 的临床操作中应注意：①对结果的判读上，由于结核分枝杆菌在脑脊液中载量很小，且脑脊液相对无菌，结核菌对生长条件要求较高，很难作为一种污染菌存在，所以在结果为阳性的时候，诊断为TBM 的可靠性还是很高的，可以在一定程度上降低特异序列数的界线范围，或许是提高检出率的一种方法。②增加脑脊液标本量，可能对检测结果有一定的影响［24］。③尽量以首次腰椎穿刺获取的脑脊液作为检测对象，虽然其中的机制尚未阐明，但已有研究表明第一次腰椎穿刺获得的脑脊液阳性率最高［23］。④患有TBM 时，脑脊液中白细胞的升高，导致宿主白细胞DNA 成为主要的背景遗传物质的来源，在检测过程中，可以通过一系列方式减少背景DNA 的存在，以提高结核分枝杆菌的检出率［12］。⑤重复多次检测，若条件允许，必要时可对脑脊液行多次mNGS 检测，以提高病原体的检出率。⑥提高测序深度（即单个样本获得的单个序列数量），由于脑脊液样本具有较低的病原体负载量和（或）大量的人类序列（如脑脊液中增高的白细胞）或环境背景污染，增加测序深度是提高灵敏度的潜在解决方案。

综上所述，TBM 的细菌学检测方法有脑脊液涂片AF染色和结核分枝杆菌培养，分子生物学检测方法有PCR、Xpert MTB/RIF 技术和LAMP 技术等，免疫学检测方法有IGRAs、ADA、LAM 检测等，其用于TBM的早期诊断均有一定不足。mNGS用于TBM 诊断的灵敏度、特异度均较高，且具有无偏倚检测、可检测混合感染、灵敏度高、检测周期短、检测结果不受抗结核药物影响等优点。