类风湿关节炎患者外周血CD4+T、CD8+T、NK细胞共信号分子CD160表达观察

崔璐，刘宇宏

延安大学附属医院风湿免疫科，陕西延安 716000

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常见的自身免疫性疾病之一，患病率和致残率较高，严重影响患者生活质量［1］。RA 发生发展的具体分子作用机制尚不明确。遗传因素、环境因素以及多种免疫细胞、细胞因子、自身抗原、肠道菌群等可能参与了RA 的发病［2］，其中免疫因素是近年RA 发病的研究热点。T 细胞、B 细胞、自然杀伤细胞（natural killer，NK）等多种免疫细胞在RA 发生发展中发挥重要作用［3］。共信号分子分为共刺激分子和共抑制分子，参与调节免疫细胞的相互作用。CD160 由Bensussan 实验室最先发现于NK 细胞表面，是在NK细胞表面识别主要组织相容性复合体（major histo‐compatibility complex，MHC）Ⅰ类分子的调节性受体［4］。CD160 通常被认为是一种共抑制分子，在CD8+T 细胞、NK 细胞表面表达多，少量表达于CD4+T 细胞表面。最近一项生物信息学研究［5］表明，CD160 是自身免疫性疾病中异常表达最显著的共信号分子。研究［6］发现CD160 的rs744877 位点与RA 易感性关系密切，有可能在RA 发病中起到一定作用。目前国内外关于CD160 和RA 发病的相关性研究较少。为此，我们观察了RA 患者外周血CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 的表达情况，分析其表达与RA 患者临床病理参数的相关性，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2019 年11 月—2021 年3 月间于延安大学附属医院风湿免疫科住院部的RA 患者80例（RA组）和系统性红斑狼疮（systemic lupus erythema‐tosus，SLE）患者60 例（SLE 组）。RA 患者符合欧洲抗风湿联盟（European league against rheumatism，EULAR）或2010 年美国风湿病协会（American col‐lege of rheumatology，ACR）提出的分类标准［7］，SLE组患者符合ACR1997 年修订的SLE 诊断标准。RA和SLE 患者排除心、肝、肾功能不全；体质量指数（body mass index，BMI）≥28 kg/m2；合并其他急、慢性疾病者。健康组选择年龄性别匹配的健康志愿者60 例。三组均签署知情同意书并通过本院伦理委员会的认可。RA 组男21 例、女59 例，年龄（58.30±12.83）岁，BMI（21.92 ± 3.64）kg/m2，病程（9.37 ±9.08）年，吸烟史14 例，红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）为（53.90±31.11）mm/h，C-反应蛋白（c-reactive protein，CRP）为（36.64 ±29.32）mg/L，白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）为16.84mL，类风湿因子（rheumatoid factors，RF）为（162.33 ± 57.31）U/mL ，抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，CCP）为（246.00 ± 32.18）U/mL，28 个关节疾病活动评分（disease activity score，DAS28）为1.01 分；SLE 组男14 例、女46 例，年龄（55.67 ± 11.68）岁，BMI（22.73 ± 3.05）kg/m2，病程（8.88 ± 5.02）年，吸烟史8 例，ESR（39.53 ± 23.76）mm/h，CRP（129.35 ±13.22）mg/L，IL-6（43.59 ± 12.38）pg/mL；健康组男20 例、女40 例，年龄（54.73 ± 14.35）岁，BMI（21.85 ± 3.45）kg/m2，吸烟史6 例。三组年龄、性别、吸烟史、BMI 等一般资料具有可比性（P均>0.05），RA 组与SLE 组患者病程、ESR、CRP、IL-6 间差异无统计学意义（P均>0.05）。

1.2 三组外周血CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 检测 RA 组、SLE 组住院期间（健康志愿者于同期）禁饮食8 h 后取晨起空腹外周静脉血3 mL，室温下EDTA 抗凝，采用流式细胞术测算外周血CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160阳性表达率。每位研究对象均取2 支流式管，分别标注管1、管2，管1 加入CD3PerCP、CD4FITC、CD8PE、CD160APC，管2 加入CD3FITC、CD（16 + 56）PE、CD45PerCP、CD160APC，各5 μL；两管分别加入100 μL EDTA 抗凝血，将所有流式管置于振荡器上震荡混匀后室温下避光孵育15 min；将各流式管取出，均加入1×FACS 溶血素2 mL，低速涡流混匀，室温下避光孵育10 min，然后置于离心机内，1 500 r/min离心5 min；弃上清，加入PBS 液1 mL，1 500 r/min 离心5 min；弃上清，加入PBS 液500 μL，使用BD FACSCantoTMⅡ机器上机观察外周血CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160，测算外周血CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 阳性表达率。操作重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理。数据全部进行正态性检验，计量资料以±s表示；多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，组间比较采用t检验，采用Pearson 相关分析法分析CD4+T、CD8+T、NK细胞CD160表达水平与RA患者临床病理参数的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组CD4+T、CD8+T、NK 细胞上CD160 阳性表达率比较 RA 组CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 阳性表达率分别为4.50% ± 3.90%、3.28% ± 2.32%、6.79% ± 3.71%，SLE 组CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 阳性表达率分别为5.25% ± 3.62%、5.00% ± 3.32%、5.68% ± 3.64%，健康组CD4+T、CD8+T、NK 细胞CD160 阳性表达率分别为5.10% ±2.32%、6.19% ± 2.51%、3.34% ± 1.43%。与健康组比较，RA 组CD8+T 细胞CD160 阳性表达率降低、NK 细胞CD160 阳性表达率升高（t分别为-2.354、2.966；P均<0.05）。

2.2 CD8+T、NK细胞CD160阳性表达与RA患者临床病理参数的相关性 CD8+T 细胞上CD160 阳性表达与RA 患者性别、年龄、病程、吸烟、BMI、血清IL-6水平、RF 无关（r分别为0.157、-0.211、-0.100、0.053、0.798、-0.860、-0.006；P均>0.05），与DAS28 评分、血清CCP 水平、ESR、血清CRP 水平呈负相关（r分别为-0.21、-0.28、-0.07、-0.07；P均<0.05）。NK 细胞上CD160 阳性表达与RA 患者性别、年龄、病程、吸烟、BMI、RF无关（r分别为-0.092、0.054、0.087、-0.060、0.918、-0.110；P均>0.05），与DAS28评分、血清CCP水平、ESR、血清CRP及IL-6水平呈正相关（r分别为0.130、0.346、0.331、0.140、0.180；P均<0.05）。

2.3 CD8+T、NK细胞上CD160阳性表达与RA患者疾病活动度的相关性 RA 患者疾病低度活动度20例，中、高度活动度各30 例，CD8+T 细胞CD160 阳性表达率分别为7.82% ± 6.70%、5.22% ± 2.81%、2.67%±2.26%，NK 细胞CD160 阳性表达率分别为1.84% ± 2.17%、4.67% ± 1.77%、9.82% ± 6.70%，随疾病活动度升高，RA 患者CD8+T 细胞CD160 阳性表达率降低，NK 细胞CD160 阳性表达率升高（P均<0.05）。

3 讨论

T 细胞控制的免疫反应在RA 发病中发挥重要作用［8］，而CD160 参与的CD160/HVEM/LIGHT/BT‐LA 通路是调节T 细胞活化的重要信号通路［9］，今后可能成为RA 新的治疗靶点［10］。因此进一步探讨CD160 的表达与RA 的关系有助于为RA 发病机制和治疗提供新的科学依据。

本研究发现，与健康组比较，RA 患者外周血CD4+T 细胞百分比、CD4+T/CD8+T 升高，CD8+T 细胞和NK 细胞百分比无显著差异，说明RA 患者有T细胞亚群的改变，RA 组CD160 呈异常表达，其中CD8+T细胞CD160的表达降低，NK细胞CD160的表达升高，说明CD160 的异常表达促进T 细胞的活化与增殖，与NK 细胞的百分比无明显关系。而RA 患者CD4+T 细胞上CD160 的表达与健康组比较差异无统计学意义，可能与CD160 细胞分布和样本个体差异有关。

RA是慢性炎性疾病，外周血ESR、IL-6等炎性生物标志物是反映RA 病情的指标之一，本研究中CD8+T细胞CD160阳性表达与RA患者ESR、CRP、抗CCP 抗体呈负相关、NK 细胞CD160 阳性表达与RA患者ESR、CRP、IL-6、抗CCP抗体呈正相关。我们前期研究发现，DAS28 评分高的RA 患者CD8+T 细胞CD160表达水平明显低于DAS28评分低的RA患者，DAS28评分高的RA患者NK细胞CD160表达水平明显高于DAS28评分低的RA患者，说明CD160表达异常程度越高的RA患者有更严重的炎症反应。

CD160 参与的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路的相关分子在自身免疫性疾病中经常存在异常表达［11］。共刺激分子在免疫性疾病中的表达不是必须上调，共抑制分子在免疫性疾病中的表达不是必须下调，没有一个确切定论。本研究中，RA 患者外周血CD160 呈异常表达，CD160 在CD8+T 细胞上表达降低，从而促进了T 细胞的异常活化。有研究［12］显示，CD160-HVEM 在调节CD4+T 细胞时发挥抑制作用，同时向NK细胞传递共刺激信号。还有CDl60与MHC-Ⅰ类配体HLA-C结合能力弱，但结合后能增强诱导NK 细胞杀伤活性，并诱导一些细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8等的分泌［13］。CD160能够与HVEM结合，以增强NK细胞的炎性细胞因子产生和细胞溶解功能［14］。以上研究结果均说明CD160可能对CD4+T、CD8+T及NK细胞的功能有直接或者间接的调控作用。但以往类似研究均只单独研究T细胞或NK细胞，我们同时纳入T细胞和NK细胞，将更好说明RA发病与CD160表达的相关性及其意义。

CD160的异常表达可能通过多种潜在病理生理机制及相关通路参与RA 的发生与发展。一是CD160 参与的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路。本研究发现CD160 异常表达与RA 发病关系密切，共信号分子的异常表达可以引起T细胞过度激活并引发自身免疫性疾病，为CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路在自身免疫性疾病中的重要作用提供了新的科学依据。SHUI 等［15］研究发现，CD160 是一种新发现的HVEM 配体，先前鉴定的HVEM 配体包括BTLA 和LIGHT，HVEM 是一种双向开关，该系统必须被适当地调节以平衡免疫反应的结果，其结果取决于配体的参与，HVEM 与LIGHT 结合可促进T 细胞的活化，但HVEM 的功能主要表现为BTLA 和CD160 介导的负调控作用，CD160 参与的CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路起刺激/抑制T 细胞活化的作用。T 细胞在RA 发病中迁移到病变关节，识别特定的抗原肽后，释放HVEM-α等数种炎症因子，促进滑膜细胞异常增殖和血管翳的形成，最终导致关节软骨和软骨下骨的破坏。据我们所知，HVEM 还可以转化为显性共刺激分子，产生增强免疫反应的作用［16］。因此，CD160 参与CD160/HVEM/LIGHT/BTLA 通路可能通过调节T 细胞的活化导致T 细胞过度激活引起新的免疫反应进而参与了RA 的发病，但具体的分子机制目前尚未明确。二是CD160与免疫细胞功能紊乱。研究［17］证实，NK细胞通过固有免疫在RA 的发病中发挥重要作用，其通过分泌细胞因子、趋化因子以及细胞间接接触等途径，引起NK细胞、T细胞、B细胞等增殖活化，参与RA滑膜增殖和骨破坏的发生与发展。CD160 主要在T 细胞亚群、NK 细胞中表达，而在B淋巴细胞中基本不表达，然而在RA 的发病过程中，T 细胞、B 细胞等多种免疫细胞都参与其中，我们知道任何一种免疫细胞的功能紊乱会进一步导致其他免疫细胞功能的异常，我们的结果显示RA 患者NK 细胞上CD160 的表达增加，因此CD160 的升高可能通过促进NK 细胞局部相互作用、分泌众多细胞因子、激活或破坏其他细胞等方式直接导致T细胞或NK细胞功能紊乱，从而使B细胞功能异常而发生RA。

综上所述，CD160 在RA 患者外周血CD8+T、NK细胞上存在异常表达，与RA 的疾病活动度相关。此外，RA 患者中的CD160 表达水平与DAS28 评分、抗CCP 抗体、炎性生物标志物相关，未来可继续探索CD160 在RA 发病机制中是如何调控免疫细胞功能，为RA的临床治疗提供新思路。