睾丸位置不同的隐睾患儿睾丸引带组织雄激素受体表达观察

高靖达，齐灿，周云，张铁军，史丽萍，许鹏，贾鹏宇

河北省儿童医院泌尿外科，石家庄 050000

隐睾又称睾丸下降不全，是指患儿出生时单侧或双侧睾丸未能正常降入阴囊内，是小儿泌尿外科常见的先天性畸形之一。新生儿隐睾发病率2%～5%，是导致不育及睾丸癌的危险因素。目前隐睾的发病机制尚未完全阐明，睾丸引带的牵拉作用可能在睾丸下降过程中发挥重要作用。睾丸的分化和发育与雄激素密切相关，雄激素必须通过其靶器官雄激素受体（AR）的介导才能发挥其生物学作用。研究［1］发现，睾丸引带组织中存在AR 表达，睾丸引带可能作为睾丸下降过程中雄激素作用的靶器官，在雄激素的作用下睾丸引带发生结构变化，参与睾丸下降过程。我们观察了不同睾丸位置的隐睾患儿睾丸引带组织AR表达情况，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2020 年1 月—2021 年8 月间河北省儿童医院泌尿外科收治的单侧隐睾患儿55例，其中左侧隐睾26 例，右侧隐睾29 例，；根据睾丸位置分为腹腔型隐睾18例、腹股沟型隐睾25例和阴囊高位型隐睾12 例；腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型睾丸引带长度分别为（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm。排除标准：①双侧隐睾患儿；②伴发其他泌尿生殖系统畸形患儿；③接受内分泌治疗及其他促进睾丸下降的治疗患儿。根据睾丸位置将患儿分为腹腔型隐睾、腹股沟型隐睾和阴囊高位型隐睾。本研究已通过河北省儿童医院伦理委员会的批准，获得患儿家长同意。

1.2 隐睾患儿睾丸引带组织AR 检测 患儿麻醉后触诊确定睾丸位置，经腹股沟切口找到睾丸，睾丸引带为睾丸远端向阴囊走形的唯一条索状组织，提起睾丸牵拉引带，可见与引带远端相连的皮肤回缩，回缩处为睾丸引带附着点，引带长度为睾丸远端到睾丸引带附着点之间的距离。术中留取患儿睾丸引带近端组织标本。分别采用免疫组织化学法、WESTERN Blotting 法检测患儿睾丸引带组织AR。①免疫组织化学法：取标本，石蜡包埋4 μm 切片，70 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS 洗涤3 次，微波炉抗原修复（中高火5 min，中低火20 min），冷却至室温，PBS洗涤3次，3%H2O2避光室温孵育10 min，PBS 洗涤3 次，滴加特异性一抗体，4 ℃孵育过夜，第二天恢复室温后PBS 洗涤3 次，滴加二抗，37 ℃孵育40 min，PBS 洗涤3 次，DBA 显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，在显微镜下×400倍随机选择10个区域，使用Image Pro Plus 软件测定平均光密度值，并以10 个视野下测的光密度值的平均值作为标本AR光密度值。研究重复3 次，取平均值。②WESTERN Blotting 法：采用组织裂解法提取睾丸引带组织总蛋白，Bradford 法测量蛋白质含量，SDS-PAGE 电泳分离蛋白质，硝酸纤维素膜转膜，脱脂奶粉封闭，AR（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，二抗IgG（1∶5 000）室温孵育1 h，化学发光法显色。以β-actin 为内参，用IMAGE J 软件分析目的条带的灰度值，以目的条带灰度值与β-actin 灰度值比值作为AR 相对表达量。研究重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，所有数据进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析；采用PEARSON 相关性分析及线性回归法分析睾丸引带长度与隐睾患儿睾丸引带组织AR 光密度值的相关性。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

免疫组织化学检测结果为：腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型隐睾患儿睾丸引带组织AR 的光密度值分别为（212.67 ± 82.84）×10-4、（288.76 ± 68.70）×10-4、（375.75 ± 52.08）×10-4，腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型隐睾患儿睾丸引带组织AR 光密度值逐渐升高，两两比较，P均<0.05。

WESTERN Blotting结果为：腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型隐睾患儿睾丸引带组织AR 相对表达量分别为0.60±0.10、0.78±0.10、0.89±0.10，腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型隐睾患儿睾丸引带组织AR相对表达量逐渐升高，两两比较，P均<0.05。

腹腔型、腹股沟型和阴囊高位型睾丸引带长度分别为（2.3 ± 0.4）、（3.1 ± 0.3）、（3.6 ± 0.5）cm 睾丸引带长度与隐睾患儿睾丸引带组织AR 光密度值呈负相关（r=-0.770，P<0.001）。

3 讨论

小儿隐睾症是小儿泌尿外科常见疾病，目前对于隐睾的发病机制目前尚未阐明。睾丸下降过程是一多因素、多阶段参与的复杂的生理过程，其主要包括腹腔内下降阶段和腹股沟阴囊下降阶段两个阶段［1-2］。睾丸下降第一阶段主要发生于胚胎10～23周左右，目前研究表明，腹腔内阶段睾丸的下降主要是由睾丸Leydig 细胞分泌的胰岛素样因子-3（Insu‐lin like3、INSL-3）在这以阶段发挥重要作用［3］，其主要通过睾丸引带上的INSL-3 受体，刺激睾丸引带生长牵拉睾丸，将睾丸从肾周分离出来，牵拉至腹股沟去。INSL-3受体目前已经被确定为富含亮氨酸G蛋白耦联受体8（leucine-richG-protein-coupled recep‐tor8，LGR8），其在睾丸曲细精管细胞膜表面结合，激活G 蛋白，使位于内膜表面的腺苷酸环化酶活性上调，从而促进引带细胞分化，睾丸位置下降。INSL-3基因突变可能影响LGR8 结构、活性及表达量，进而导致引带退化而使睾丸下降受阻，最终导致隐睾。睾丸下降第二阶段主要始于胚胎26～28 周，至出生完成，目前认为，雄激素在此阶段发挥重要作用［4］，并且诱导腹股沟管和外生殖器官的发育，在此过程中睾丸引带扮演重要的角色，但雄激素通过何种途径和机制影响引带，并通过它进一步影响生殖系统的发育尚存在很大争议。GEORGE 等［5］首次研究发现，睾丸引带上存在AR 表达，为雄激素的直接作用提供了理论依据。PARK等［6］研究发现，在睾丸下降过程中睾丸引带存在节律性收缩，该过程与生殖股神经（GFN）及其神经递质降钙素基因相关肽（CGRP）的调节相关，并进一步证实了雄激素可能通过位于脊髓的GFN 核上的AR 调节GNS末梢分泌CGRP，CGRP再作用于睾丸引带CGRP受体，发挥影响睾丸引带的作用。

在孕早期，胎儿睾丸引带由稀疏的胶原纤维和松散的细胞外基质构成，随后胶原纤维不断增加，弹性纤维也以同样的方式增加，纤维母细胞成为占主导地位的细胞类型，随着孕龄的增加而降低，平滑肌细胞主要位于血管壁；横纹肌细胞位于睾丸引带的远端近阴囊处，分成不同方向的几束，其含量随孕龄的增加而降低［7］。睾丸引带在睾丸下降过程中的不同阶段发生着不同的变化，主要可以分为引带组织肿胀阶段和引带组织退化阶段。第一阶段主要表现为以下特征：细胞明显增殖，粘多糖及透明质酸钠大量积聚，细胞内水分增多，细胞外基质增多［8-9］。HO‐SIE 等［10］提出雄激素对睾丸发育影响有可能通过增加粘多糖引起睾丸引带组织肿胀，扩张腹股沟管，从而促进睾丸下降。林庆军等［11］通过对小鼠引带组织AR 表达的研究发现睾丸引带积极参与了睾丸一期下降过程，并且与雄激素代谢密切相关，雄激素通过引带AR 增强引带发育，并促进或成为睾丸下降奠定基础。第二阶段主要表现为伴随睾丸下降，睾丸引带长度的缩短；在雄激素介导作用下，细胞内积聚的粘多糖及透明质酸钠成分降解，细胞外基质呈脱水改变，睾丸引带细胞出现凝聚反应［12］。雄激素缺乏与睾丸引带退化失败关系密切，两者的密切关系对于阐明雄激素介导睾丸下降具有重要意义［13］。

BARTECZKO 等［14］研究认为，睾丸引带发育可分为三个时期：Ⅰ期为早期，引带结构通过中肾管皱褶的尾部与腹侧壁相连至脐动脉；Ⅱ期可看到引带的腹侧面紧密连接于腹膜鞘突的背侧面，在它们的相交处引带头端插入生殖管的间质部，引带尾端将睾丸尾端和生殖管间质的背部连在一起。Ⅲ期时可以观察到引带的内部结构并可通过性腺位置判断性别，此期睾丸体积增大并靠近生殖管的间充质。并且研究还发现睾丸引带与腹膜鞘突的结构和排列与睾丸下降关系密切，与临床上隐睾总是与睾丸引带和腹膜鞘突异常关联的情况一致。

睾丸与附睾自腹腔内的下降过程中依赖于位于其远端的睾丸引带的发育和重塑。对于睾丸引带的作用机制，现在认为睾丸引带上存在许多与睾丸下降有关的受体，多种因子作用于睾丸引带上的这些受体后会产生收缩性改变和位置迁移，从而促使睾丸下降。本研究中观察了不同睾丸位置的患儿睾丸引带组织AR 表达后发现，睾丸位置较高的隐睾患儿睾丸引带组织AR 低表达，睾丸引带长度较长，随着睾丸位置的降低，睾丸引带长度逐渐缩短，睾丸引带组织中AR 表达增多，且睾丸引带长度与睾丸引带组织AR 表达成线性相关。在睾丸进入阴囊阶段，睾丸引带引导睾丸通过扩张的腹股沟管进入阴囊，同时引带逐步缩短退化，含水量不断减少，纤维成分不断增加，最终退化成纤维带，锚定睾丸于阴囊内［15］。刘新福等［16］研究表明睾丸引带参与引导和牵拉睾丸进入腹股沟和阴囊，并最终退化形成在附睾与阴囊之间固定睾丸并阻止其上升。目前研究均已表明睾丸下降过程中第二阶段，睾丸引带组织退化的重要作用，与本研究中随睾丸位置降低，睾丸引带组织退化的表现相一致，进一步说明在睾丸下降第二阶段过程中雄激素发挥重要作用。

综上所述，阴囊高位型隐睾患儿睾丸引带组织AR 表达高于腹腔型、腹股沟型患儿。睾丸引带长度与隐睾患儿睾丸引带组织AR 光密度值呈负相关。睾丸位置较高的隐睾患儿睾丸引带组织AR 表达低，睾丸引带长度较长。睾丸引带组织AR 表达可能参与了睾丸下降。深入研究雄激素在睾丸引带发育中的作用机制，有利于进一步对睾丸下降机制的了解，为激素治疗隐睾理论研究提供新思路。