HLA-G 3′UTR基因多态性与精神分裂症发生风险的相关性研究

乔瑞娟 张守亮 张晨光

精神分裂症是严重的慢性精神性疾病，其主要症状为幻觉、妄想、人格障碍和认知功能障碍[1]，给患者、亲属及整个社会带来很大的痛苦和负担。目前，精神分裂症的病因仍不明确，遗传、心理和环境因素均参与精神分裂症的发病，其中遗传因素解释70%～90%的表型变异[2]，通过全基因组关联分析，目前已经发现许多与精神分裂症相关的易感基因，主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)已经成为一个重要的研究对象，它是患精神分裂症最强的风险基因之一[3-4]。人类白细胞抗原G(human leucocyte antigen protein G，HLA-G)位于6p21.31上，是一种非经典的MHC I类分子，其在胚胎发育过程中发挥重要作用，既往研究[5-6]表明HLA-G的多态性与病毒感染、子痫前期、炎症、肿瘤的发展、移植及自身免疫性疾病相关，HLA-G的异常表达会导致妊娠并发症，从而增加后代患精神分裂症的风险。Rajasekaran等[7]研究表明，携带HLA-G 14 bp ins/ins基因型患精神分裂症风险显著增加，由此推断HLA-G基因多态性很有可能与精神分裂症发生风险相关。人类白细胞抗原G 3′非翻译区(human leucocyte antigen protein G 3′untranslated region，HLA-G 3′UTR)通过影响mRNA的加工和稳定性在HLA-G的表达调控中发挥重要作用，目前国内相关研究较少，本研究通过检测健康人群和精神分裂症患者HLA-G 3′UTR基因多态性，探讨HLA-G基因多态性与精神分裂症发病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月至2017年10月被新乡医学院第二附属医院确诊为精神分裂症的302例患者作为病例组。精神分裂症的诊断均符合《国际疾病和分类》 简称ICD-10(第10版)精神分裂症[8]的诊断标准，排除标准：①有严重的躯体疾病者；②妊娠期或哺乳期的女性；③合并其他神经系统疾病者。对照组由该院同时期327例健康体检者组成，排除标准：①有精神性疾病家族史者；②有不良孕产史女性者；③有神经系统疾病病史者。两组对象均为汉族，年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。本研究经新乡医学院第二附属医院伦理委员会批准(批准文号：XYLL-20195025)，事先获得参与本研究的每位患者及其监护人和健康者的知情同意，自愿参与本项研究。

表1 两组对象一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 外周血基因组DNA提取 使用北京康为世纪生物科技有限公司生产的外周血基因组提取试剂盒分离出全血DNA，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增 采用PCR扩增HLA-G3′UTR，引物序列如下：F：5′-GTTGAGGGGAACAGGGGACAT-3′；R：5′-AAAGTTCTCATGTCTTCCATTT-3′，扩增产物为489 bp。PCR扩增体系共25 μL，包括2×PFUMasterMix 12.5 μL、去离子水10.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 1 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min变性，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共循环33次，最后在72 ℃延伸10 min。将扩增产物样本送北京金维智公司进行Sanger测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，偏态分布计量资料用M(P25，P75)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料用频数或率表示，组间比较采用χ2检验。通过DNAstar V7.0 软件分析各个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点，使用SHEsis软件进行哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg，H-W平衡)、等位基因和基因型频率、连锁不平衡及单倍型检测。采用logistic回归分析对4种遗传模型(共显性、显性、隐性和超显性)进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间HLA-G 3′UTR基因多态性位点等位基因及基因型分布情况 在HLA-G 3′UTR区域共检测出10个多态性位点，分别为14 bp ins/del、+3003 C/T、+3010 G/C、+3027 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A、+3072 C/A、+3142 C/G、+3187 A/G、+3196 C/G，仅有14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A这3个位点符合H-W平衡(P>0.05)。

两组间等位基因分布相比，+3035 C/T位点等位基因分布差异有统计学意义(OR=1.522，95%CI：1.146～2.022，P=0.004)，但两组间14 bp ins/del和+3058 G/A位点等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。对照组和病例组患者中，14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A位点的基因型分布最高频率分别为纯合del/del、CC和GG，+3035 C/T基因型分布在病例组和对照组间差异有统计学意义(P=0.019)，而14 bp ins/del、+3058 G/A位点基因型分布在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组HLA-G 3’UTR基因多态性位点等位基因分布情况[例(%)]

表3 两组HLA-G 3’UTR基因多态性位点基因型分布情况[例(%)]

2.2 +3035 C/T位点不同遗传模型与精神分裂症易感性的关联 +3035 C/T位点的共显性模型中，与CC基因型相比，CT基因型(OR=1.450，95%CI：1.019～2.062，P=0.039)和TT基因型(OR=2.275，95%CI：1.064～4.867，P=0.030)与精神分裂症的易感性相关。+3035 C/T位点的显性模型[(CT+TT) 比 CC，OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)]与精神分裂症的易感性相关。而在+3035 C/T位点的隐性模型中[(CT+CC)比 TT]和超显性模型中[CT 比 (CC+TT)]，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 +3035 C/T位点不同遗传模型与精神分裂症易感性的关联情况[例(%)]

2.3 HLA-G 3’UTR基因多态性位点连锁不平衡和单倍型分析 14 bp ins/del与+3035 C/T之间D′与R2分别为(0.24，0.20)；14 bp ins/del与+3058 G/A之间D′与R2分别为(0.79，0.20)，+3035 C/T与+3058 G/A之间D′与R2分别为(0.23，0.00)。见图1。

图1 HLA-G 3’UTR 3个SNP连锁不平衡分析

通过对这3个位点进行单倍型分析，共得到9个单倍型，对于单倍型频率小于3%的单倍型不予比较分析，剩余4个单倍型，分别为H1(DCG)、H2(DTG)、H3(ICG)、H4(ITG)，病例组和对照组主要的单倍型均为H1(DCG)，两组间单倍型H1及H2频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，单倍型H3(ICG)和单倍型H4(ICG)在两组中的分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 两组HLA-G 3’UTR单倍型分布

3 讨论

精神分裂症是一种复杂的精神疾病，涉及多种遗传和环境因素的相互作用，最近的全基因组关联研究[9-10]数据表明，常见的多基因变异与患精神分裂症风险显著相关。Liu等[11]发现GABRB3 5′启动子区rs4906902和rs8179184与精神分裂症相关，C-A单倍型可能增加患精神分裂症的风险;Azari等[12]发现GRM7基因rs779867位点的GG基因型与伊朗精神分裂症的发病风险相关，该SNP在共显性和显性模型中与精神分裂症发病相关。除遗传变异外，由于暴露于环境逆境亦可导致精神分裂症[13-14]，这些研究涉及免疫相关基因，这些基因在基因与环境的相互作用中起着至关重要的作用，MHC已被确定为精神分裂症的相关的最强危险因素之一[3-4]。

位于6 p 21.31上的HLA-G是非经典的MHC-I类分子，HLA-G作为一种重要的免疫调节分子，通过其免疫调节功能，在各种癌症、自身免疫性疾病、病毒、寄生虫感染的发病机制中发挥作用。与此同时，HLA-G被证明与各种精神疾病有关，例如“低表达”(HLA-G 14bp Ins/Ins)基因型在冬季出生的双相障碍患者中较少见，提示14 bp Ins/Ins可能作为双相障碍的保护性基因型[15]。此外，14 bp Ins/Ins基因型和14 bp Ins等位基因频率在自闭症谱系儿童以及他们的母亲中显著增高[16]。Rajasekaran等[7]发现14 bp Ins/Ins基因型具有很高的患精神分裂症风险。HLA-G基因在5′URR(上游调控区)和3′UTR(非翻译区)有许多多态性位点。5′URR的多态性影响HLA-G基因的转录，而3′UTR的多态性影响mRNA的加工和稳定性。HLA-G的表达受3′UTR的多态性调控，目前研究较多的多态性位点为14 bp、+3187 A/G和+3142 C/G，在此区域还有其他多态性位点如+3010 G/C、+3072 C/A、+3035 C/T、+3058 G/A等，关于这些位点与精神分裂症的研究相对较少，故本研究旨在研究HLA-G3′UTR基因多态性与精神分裂症的关系，为精神分裂症的发病风险提供理论依据。

本研究发现，在HLA-G 3′UTR这个区域共检测出10个多态性位点，仅14 bp ins/del、+3035 C/T、+3058 G/A这3个位点符合H-W平衡。通过对两组间等位基因和基因型分布进行分析发现，14 bp ins/del位点基因多态性与精神分裂症的风险无关，与Rajasekaran 等[7]的研究不一致，出现这种现象的原因可能是由于研究的人群和种族不同，导致基因多态性位点分布不同。本研究发现，+3058 G/A位点基因多态性与精神分类症的风险无关，而+3035 C/T位点基因多态性与精神分类症的风险相关，携带T等位基因的个体发生精神分裂症的风险约是携带C等位基因的1.522倍。通过+3035 C/T位点各个遗传模型研究发现，+3035 C/T位点的共显性模型中，携带CT基因型和TT基因型的个体发生精神分裂症的风险约是携带CC基因型个体的1.450和2.275倍。+3035 C/T位点的显性模型(OR=1.547，95%CI：1.108～2.161，P=0.010)与精神分裂症的易感性相关。在人类基因组中常存在连锁不平衡现象，可以用来定位参与疾病诊疗的相邻变体，通过对HLA-G的3个多态性位点进行分析，未发现这3个位点具有连锁现象(R2<0.8)。通过对HLA-G 3′UTR单倍型分析发现，单倍型H3对精神分裂症的发病具有保护作用(OR=0.663，95%CI：0.508～0.866，P=0.002)，而单倍型H4(ICG)可以增加患精神分裂症的风险(OR=1.622，95%CI：1.098～2.397，P=0.014)。

综上所述，HLA-G +3035 C/T位点基因多态性与精神分裂症的易感性相关，等位基因T可能是发生精神分裂症的易感基因，从基因水平上研究了精神分裂症可能的发病原因，可能为精神分裂症的发病机制提供理论基础。本研究也存在一定局限性：本研究为单中心研究，且本研究的样本量有限，可能会存在样本偏倚，因此需要在多个地区、不同民族及人群中进行验证，以此来降低研究结果的偶然性。此外，本次研究缺乏患者的生存数据， HLA-G 3′UTR多态性是否与精神分裂症患者的生存有关需要进一步研究。