核酸药物研究进展及挑战

董志辉 许小丁

中山大学孙逸仙纪念医院基础医学与转化中心（广州 510120）

目前，大多数临床批准的药物，包括用于癌症的药物，都是基于小分子或蛋白质/抗体的生物制剂。核酸药物作为新一代药物，研发工作者付出了巨大努力。半个世纪前，FRIEDMANN 和ROBLIN［1］提出了一个概念：通过引入功能基因拷贝，可以治疗功能性基因产物引起的遗传性疾病。此后，核酸药物克服各种挑战，制定适当的疾病选择策略，目前主要针对罕见疾病进行治疗。如今，核酸药物治疗仍处于全球抗击2019 冠状病毒病（COVID-19）大流行努力的前沿［2-4］。

核酸类药物能够根据核苷酸的序列信息调控细胞的生物学功能。这些药物发挥功能要么是基于它们在细胞中的表达，要么是通过基因调节，特别是那些具有互补序列的基因的调节。这些机制为核酸药物提供了一个主要优势，即无论目标分子的定位或结构如何，核酸药物都可以被设计，用来靶向这些小分子或抗体无法达到的目标分子。本文主要综述了三种核酸类药物：DNA 药物、信使RNA（mRNA）药物以及小干扰RNA（siRNA）药物的工作原理及应用等。但是考虑到它们的大体积和负电荷的特点，以及基因在体内递送存在的生物屏障，这些大分子的递送通常需要经过结构的改性，或者需要一些递送系统如纳米递送系统的结合来达到长期有效的治疗效果。

1 核酸药物的分类

1.1 DNA 药物 反义寡核苷酸（ASO）作为一种常见的DNA 类药物，是长度在13 ～30 碱基的单链短DNA 序列。ASO 通过利用与靶基因互补的寡核苷酸序列，在靶点位形成DNA/RNA 双链结构，导致基因功能被抑制。ASO 除了靶向mRNA 基因外，也可以靶向Micro RNA（miRNAs），在这种情况下，靶向miRNA 的ASO 被称为antimir 或antagomir［5-6］。ASO 发挥作用的方式不仅可以通过形成一个强大的双链结构导致空间位阻，还可以诱导RNase H切割RNA 链。RNase H 是一种内源性酶，能够识别DNA/RNA 双链，并特异地切割RNA 链。因此，ASOs形成的双链可以催化RNase H的定向切割［7］。

ASOs 的研究早于其他核酸药物。Fomivirsen是一种ASO 药物，于1998年被批准为美国第一个核酸药物［8］。随后批准用于临床的反义寡核苷酸药物还有mipomersen［9］和inotersen［10］等。

1.2 mRNA 类药物 mRNA 类药物由成百上千个核苷酸组成。不同于以寡核苷酸为基础的药物类别，mRNA 药物能够直接导入靶细胞，以蛋白质的形式表达［11-12］。mRNA 药物不需要细胞核定位，从而避免了基因组整合导致的突变，因此，这些药物被认为是高度安全的。WOLFF等［13］在1990年首次报道了肌内注射mRNA 到小鼠骨骼肌诱导编码蛋白的表达。从那时起，以mRNA 为基础的治疗方法在各种应用中得到了研究，包括癌症治疗、传染病疫苗、蛋白质替代和细胞基因工程。特别是自2020年COVID-19 大流行爆发以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）疫苗的临床试验进展迅速。例如：2021年8月23日，美国食品和药物管理局（FDA）首次批准的Comirnaty COVID-19疫苗以及2020年12月18日FDA 批准的Moderna COVID-19 疫苗，都属于mRNA 类核酸药物。

1.3 siRNA 类药物 合成的siRNA 是双链RNA，是模仿细胞内的双链RNA 专一性RNA 内切酶（Dicer 酶）将外源性双链RNA（dsRNA）切割的产物，一般为20～30 个核苷酸长度［14-15］。当外源性的siRNA 进入细胞后，与细胞内的解旋酶以及其他因子结合形成RNA 诱导沉默复合物（RISC）［16］。激活的RISC 通过碱基互补配对原则定位到同源mRNA 转录本上，在距离siRNA 3′端12个碱基处切割mRNA，特异性地阻断体内特定基因的表达，诱发细胞呈现出特定基因表达降低表型。siRNA 对于由基因异常表达或基因突变引起的疾病，如癌症、病毒感染和遗传疾病等的治疗具有巨大的应用潜力。并且由于其RNA 干扰过程发生在细胞质中，不需要穿透细胞核，这使siRNA 核酸药物的开发更具吸引力。Patisiran 是2018年美国FDA 批准的第一种siRNA 药物［17］，在此之后，2020年FDA 又相继批准三种siRNA 类核酸药物。

2 核酸药物面临的挑战及解决办法

核酸药物具有其他药物所没有的优异性能，但也面临着诸多挑战。事实上，未经修饰的核酸根本无法进入细胞，除了由于核酸本身的低稳定性外，还包括半衰期短、容易被内源性核酸酶降解、被肾小球过滤并经过尿液排出体外、被细胞摄取效率低以及核酸的免疫原性等，使得核酸药物的临床应用受到极大的限制［18-19］。大多数已获批或正在进行Ⅲ期临床试验的核酸药物，要么是局部给药（包括鞘内给药），要么是通过全身循环肝脏给药，研究者们一直在为将核酸药物高效传递到其他组织（如肿瘤组织）中而努力。目前所应用较多的提高核酸药物递送效率的方法包括核酸药物化学修饰和纳米递送系统。

2.1 核酸药物的化学修饰 为保证核酸药物的成药性，提高其抗酶解的能力等，研究者对核酸药物进行了各种化学修饰。此类修饰主要包括：碱基修饰、磷酸基团上的修饰、核糖部分的修饰、核糖-磷酸骨架修饰以及针对核酸药物的组合修饰等。

碱基修饰中一般在嘧啶碱基的5′-位以及嘌呤碱基的8′-位引入羧基、咪唑基、芳香基以及氨基等功能基团，来达到增强对靶基因的亲和性、提高核酸药物的化学活性以及稳定性等目的；磷酸基团的修饰作为目前使用最广泛的修饰方法，其典型例子包括硫代磷酸化［20］，核苷酸链中磷酸基团上带双键的氧原子被硫原子取代。一方面，使得修饰之后的核酸类药物具有抗核酸酶降解，并增强与血浆蛋白的结合，阻止快速的肾清除，增强其生物利用度。另一方面，硫代修饰序列与靶RNA形成的杂交双螺旋片段能被RNase H 识别并降解靶RNA。但是不足之处是高浓度带来的免疫毒性的副作用，以及对靶序列的亲和性相对较低；核糖部分的修饰中较为常见的是在核酸中糖2′-位引入一个取代基的修饰［20］。2′-甲氧基、2′-甲氧基乙氧基和2′-氟是具有糖基的核酸最常见的修饰［21-22］。此外，2′-O，4′-C-亚甲基桥连核酸/锁定核酸（2′，4′-BNA/LNA）、2′-O、4′-C-乙烯桥连核酸（ENA）等核糖部分的修饰都可以增强核酸酶的稳定性和对靶标RNA 的亲和力；核糖-磷酸骨架修饰主要有两种方式：吗啉磷酰二胺寡聚体（PMO）［23］和肽核酸（PNA）［24］修饰。高亲和性的PMO 具有很好的水溶性，能够与各种RNA 结合，以达到干扰RNA 剪接和抑制mRNA 翻译的效果，有几种此类核酸药物已处于临床试验阶段；组合修饰的方法能够有效避免单一修饰所带来的弊端，例如：糖修饰的核酸由于其高的RNA 结合强度，有助于形成强大的双链，然而RNase H 不能识别它们。因此，通常引入gapmer 结构，其中糖修饰的核酸放置在ASO 的两端，PS-DNA 修饰部分放置在中间，中间的PS-修饰部分可以被RNase H 识别，达到降解mRNA 的目的［25］。

2.2 纳米递送系统 病毒载体是应用最早的核酸药物体内递送的载体，但是由于其本身难以大规模制备、具有潜在的免疫原性和致突变性等缺点［26］，目前已经不是核酸药物体内递送的首选。理想的核酸药物递送系统通常需要具备五个条件：（1）生物相容性较好，不引起机体的免疫反应；（2）体内血液循环时间长，不被核酸酶降解；（3）靶向性较好，在病灶部位富集量高；（4）细胞摄取量高；（5）被细胞摄取之后能够快速高效地从内涵体中逃逸出来。因此，非病毒载体尤其是纳米载体，由于其较好的生物相容性、低的免疫原性以及容易被大规模制备等特点，成为核酸载体选择的新起之秀［27］。

以恶性肿瘤为例，研究者们基于实体瘤组织特殊的生理微环境［28-29］，如：弱酸、缺氧环境、特定酶如基质金属蛋白酶（MMP）的过度表达、肿瘤细胞中存在高水平的反应活性氧（ROS）以及高浓度的还原性物质如谷胱甘肽（GSH）等特点，构建了一系列肿瘤微环境响应型纳米载体。例如：本团队设计合成的一种包含酸响应基团的肿瘤组织弱酸性响应纳米材料Meo-PEG-b-PHMEMA［30］，该材料的pKa为6.9接近肿瘤组织pH（6.5～6.8）。该纳米载体上的亲水性的PEG 外壳能够大大延长siRNA的体内循环时间［31］，当纳米载体利用肿瘤组织的高滞留效应（EPR 效应）富集到肿瘤组织后，PHMEMA 链被质子化导致纳米结构的解散［32］，疏水性的内壳siRNA 与两亲性功能肽TCPA 复合物释放出来，随后TCPA 一方面利用其结构中的RGD肽序列携带siRNA 靶向肿瘤细胞，另一方面利用其结构中具有膜穿透功能的寡聚精氨酸序列协助siRNA 的内涵体逃逸，达到基因沉默从而抑制肿瘤生长的目的；除此之外研究者还利用乏氧响应基团2-硝基咪唑［33］、偶氮苯基团［34］设计了一系列乏氧响应型纳米载体；由于肿瘤组织中基质金属蛋白酶的活性较高，WANG 等［35］设计合成了一种基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9）响应的两亲型高分子材料聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）向肿瘤部位递送siRNA；依据苯硼酸或苯硼酸酯的ROS响应性，LI 等［36］设计制备了一种苯硼酸修饰的ROS 响应的纳米载体用于siRNA 的体内递送和结肠癌治疗；同时基于肿瘤细胞内一些抗氧化物质（如GSH）表达较高［37］，本团队［38-39］设计合成一种GSH 响应的Cys-PDSA 纳米载体，用于MYC siRNA（siMYC）或Kinesin family member 11 siRNA（siKIF11）的体内递送和前列腺癌治疗。

3 总结与展望

将核酸药物安全高效的递送入细胞并发挥其编辑、剪接、替换或抑制的功能，实现致病基因的长期抑制以及抑病基因的过表达，是一种理想的治疗方案。从1990年第一次将基因导入细胞并成功表达，到如今已经有多种核酸药物经过审批并应用于临床治疗。核酸药物在化学修饰、递送载体等方面积累了丰富的经验，除小分子药物和抗体药物外，核酸药物正在被建立成为第三种治疗模式。利用核酸药物不同于常规药物的特点，能够针对性选择靶点，对一些不存在治疗药物的罕见疾病开发出核酸药物。但是到目前为止，核酸药物依然没有被广泛应用于各类疾病的治疗。希望研究者们对生物学的进一步了解能够帮助克服与核酸药物相关的挑战，并在不久的将来增加新的治疗选择。