时差成像技术用于胚胎选择的研究进展

陈志坚，汪彩珠

近年来出现的胚胎时差成像（time-lapse imaging，TLI）技术是一种通过瞬时曝光连续拍摄记录胚胎形态动力学参数的技术，能够对胚胎体外发育过程进行全程监控，获取胚胎发育的动态信息，进而为选择高发育潜能胚胎提供更多参考信息，是一种新的无创胚胎质量评估体系。现对目前国内外利用TLI技术及其获取的形态动力学参数进行胚胎选择的相关研究进展进行综述。

1 胚胎形态动力学参数与胚胎发育潜能的关系

胚胎形态动力学参数分为形态学现象和定量参数。理论上，胚胎内部的发育异常是能够通过形态学或分裂参数异常表现出来的。目前，研究较多的异常形态学特征有异常分裂（如直接分裂、无序分裂和反向分裂）、卵裂球大小不均、多核以及碎片化。从机制上看，直接分裂可能与分裂时染色体在卵裂球中异常分布导致三级纺锤体的形成有关。2015年，Yang等[1]根据前3次细胞分裂过程中异常分裂模式的严重程度和发生情况，将发育至第3天的胚胎分为6级（A～F级），异常程度较低的胚胎（A、B和C级）比异常程度较高（D、E和F级）的胚胎具有更高的发育潜力。卵裂球大小不均表明在分裂过程中遗传物质的不均等分离或胞质分裂失败。2014年Liu等[2]研究表明，卵裂球融合或胞质分裂失败显著影响胚胎发育，最终导致胚胎植入潜能差。这种异常分裂胚胎通常与染色体数量异常有关。多核现象通常与较低的囊胚形成率、种植率和妊娠率有关[3-4]。多核发生的可能机制包括核分裂时胞质未发生分裂、核部分断裂以及有丝分裂后期染色体的迁移缺陷等。

定量参数包括以受精时间（t0）为起始点的绝对时间以及胚胎分裂至不同细胞时期之间的相对时间。常用指标有：原核出现时间（tPNa），原核消失时间（tPNf），胚胎发育至2细胞的时间（t2），发育至3细胞的时间（t3），以此类推的t4～t8；细胞开始融合的时间点（tSC），融合的时间（tMf/p），囊胚腔形成的时间点（tSB），囊胚扩张的时间点（tEB），囊胚孵化的时间点（tHB），囊胚腔充满整个透明带的时间（tB）。还有一些细胞周期时长指标，比如：2细胞分裂到3细胞的持续时间CC2=t3-t2，3细胞分裂到5细胞的持续时间CC3=t5-t3，3细胞分裂到4细胞的持续时间S2=t4-t3，5细胞分裂到8细胞的持续时间S3=t8-t5等。2010年，斯坦福大学医学院的研究人员Wong等[5]研究发现，在受精第2天可通过测量3个动态参数预测囊胚的形成，其敏感度和特异度可超过93%，这3个参数分别为：①第一次细胞分裂持续时间为（14.3±6.0）min；②第一次有丝分裂结束至第二次有丝分裂起始的间隔时间为（11.1±2.2）h；③第二次有丝分裂至第三次有丝分裂的间隔时间为（1.0±1.6）h。2013年Herrero等[6]使用TLI监测了1 806个第1个或第2个卵细胞质内单精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）周期的9 530枚胚胎，结果发现早期参数（t2、t3、t4）可以作为胚胎短期发育的良好预测因子，而晚期参数（t5、t8）预测囊胚阶段的生存能力更佳。王世凯等[7]的研究发现，t2、tSC、tMf/p和tSB可能与囊胚的形成有关，可以预测胚胎的发育潜能。而郑爱燕等[8]发现6细胞以上且碎片较少的胚胎，其t5、CC2、CC3、S2和S3不仅能预测囊胚的形成，还能预测囊胚的质量。可以看到，很多研究都报道了形态动力学参数可以用于预测胚胎发育潜能，但是各研究之间得出的指标并不完全一致。事实上，很难分离出适合所有实验室的形态动力学预测指标，促排卵方案的不同、实验室环境和培养体系的差异等也可能是造成研究结果间差异的因素。

2 胚胎形态动力学参数与染色体整倍性的关系

胚胎染色体异常是导致胚胎着床失败和反复流产的主要原因。 胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）是确定胚胎染色体整倍性的重要工具，其应用有效地避免了因染色体异常导致的妊娠失败或新生儿缺陷，显著提高了移植成功率和活产率[9]。但是，PGS技术需要通过侵入性手段即胚胎活检来完成，同时由于需要等待活检后的遗传学检测结果，胚胎必须先进行冷冻保存再等待复苏，而胚胎活检、冷冻复苏等操作都可能会对胚胎造成损伤，影响胚胎发育。因此在这些局限性因素的影响下，开发非侵入性的染色体检测技术至关重要[10]。理论上，染色体正常与不正常的胚胎应该存在动力学行为差异。因此，TLI技术的出现为寻找无创筛查技术带来了希望。2014年Basile等[11]结合TLI和PGS的数据，并应用逻辑回归分析确定了变量t5-t2是与染色体正常与否最相关的指标，其次是CC3。在此基础上，Basile提出了一种胚胎选择方法：将胚胎依据指标的差异分为A、B、C、D共4类，结果显示，各类间染色体正常百分比存在显著差异（A类35.9%，B类26.4%，C类12.1%，D类9.8%），提示该算法可在没有PGS的情况下用于无创性选择染色体正常胚胎。该团队随后进行了另一项研究，比较了单体、三体和复杂非整倍体（多于一条染色体异常）胚胎的形态动力学数据，结果发现三体和单体胚胎与正常胚胎间没有统计学上的显著差异，但复杂非整倍体的t3、t5、CC2、CC3、S2和t5-t2与正常胚胎间的差异有统计学意义。逻辑回归分析结果表明t3和变量t5-t2是预测胚胎是正常还是复杂非整倍体的最佳参数[12]。最近的研究提示，发育速度快的囊胚更偏向于为整倍体胚胎[13-14]。2020年邹曜宇等[13]对150例行植入前遗传学检验（preimplantation genetic testing，PGT）助孕患者的550枚胚胎进行回顾性分析，发现非整倍体胚胎的t4较整倍体胚胎明显延长且S2分布向右偏移，同时tHB有增加趋势。另一项研究发现，除t8外，整倍体胚胎从tPNf发育到tB的整个过程中的分裂时间点均比非整倍体胚胎要早[14]。

3 TLI技术在国内外的应用现状

近年来，国内外已有许多中心应用TLI进行胚胎培养及优选胚胎，且多个中心报道使用TLI培养胚胎可提高临床妊娠率，降低妊娠早期的流产率[15-17]。据已发表的关于TLI的文献分析，国内已有22个中心应用了TLI。青海省人民医院生殖中心分析了128例TLI培养与1 128例传统培养的卵裂期移植的妊娠和新生儿结局，发现TLI培养的胚胎具有更好的发育潜能，临床妊娠率、着床率、活产率和抱婴回家率显著提高，可以改善妊娠结局[18]。山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心报道，采用TLI培养获得了比传统培养更高的可用胚胎率[15]，而重庆市妇幼保健院遗传与生殖研究所报道可利用囊胚率在TLI培养组和传统胚胎培养组间无明显差异[16]。这是因为2个中心的数据纳入标准不同，前者统计的是发育第3天的卵裂胚胎可用率。而在国外，TLI的应用更普遍。2019年，Mascarenhas等[19]回顾性地分析了英国一中心使用TLI的1 064个体外受精周期和使用传统培养方法的818个体外受精周期，发现采用TLI技术组新鲜周期移植的活产率更高。Kalleas等[20]对英国曼彻斯特圣玛丽医院2013年6月—2014年6月体外受精周期进行了研究，结果表明与使用台式培养箱相比，使用TLI培养活产率更高，妊娠早期流产率更低。

由于TLI记录的参数众多，各参数的预测效果报道也不一致，因此，建立耦合多种参数的数学模型可能是比较有前景的方式。但是，目前各个中心都处在研发各自的胚胎选择模型中，因此尚未有关于TLI选择的共识模型得以广泛推广应用。2013 年Conaghan等[21]基于美国的5家体外受精诊所TLI数据发布了名为EevaTM Test的首个计算机自动化囊胚预测模型。EevaTM Test与传统的D3形态学评分结合，显著提高了预测可用囊胚的能力，并减少了胚胎学家之间的差异性。2016年Petersen等[22]提出了预测胚胎发育潜能的KIDScore 算法模型，且随后Cunegatto等[23]证实该模型可用于评估胚胎的整倍体率，动态评分较高的胚胎整倍体率更高。2015年Basile等[24]建立的基于决策树的分层模型可将胚胎分成10类（A+，A，B+，B，C+，C，D+，D，E和F），高评分类别中的胚胎植入率更高。最近，李国臻等[25]提出了一个胚胎优选模型，首先排除多精受精及异常发育来源的胚胎，随后根据形态学优选胚胎，在无法根据形态学挑选出质量最好的胚胎时，比较t2～t8与理想分裂时间的吻合度，如果仍不能区分出最佳胚胎，再根据CC1（8.5～14 h）、CC2（越短越好）、CC3（9～15 h）和s3（越短越好）优选胚胎。该模型简单且操作性强，在可供选择的胚胎较多时比常规形态学胚胎选择可能具有较大的优势。

4 TLI用于胚胎选择的利弊

TLI是将传统胚胎培养装置和光学成像技术进行结合，在固定的时间间隔点使用不同焦距对胚胎进行数次拍摄，获取不同层面的影像，并自动识别某些特定的胚胎发育过程，并记录其发生时间的培养和成像技术[26]。通过TLI可以回溯胚胎的发育过程并进行胚胎选择。与传统的培养体系相比，TLI培养能够避免胚胎被多次移出培养箱观察，为胚胎发育提供了更稳定的温度、湿度、pH值及气体含量等培养条件。

但由于TLI存在高频率的曝光摄像，因此其安全性也备受关注。目前已有大量研究表明，TLI培养体系没有影响胚胎的发育，其培养效果甚至优于传统胚胎培养系统[16,18,27]。而关于对胚胎植入后的影响，2017年Insua等[28]首次探讨了TLI培养系统对围生期结局的影响，结果表明，移植使用TLI系统培养的胚胎，未观察到对产科和围生期结局的不良影响，提示TLI是传统胚胎培养技术的安全替代方法。然而，Racowsky等[29]认为该研究存在样本量小等问题。因此，对TLI的安全性，尤其是对围生期及新生儿的影响，尚需要大样本的前瞻性研究去论证。另一方面，目前TLI的使用过程中仍需要胚胎学家对一些形态学指标进行人工校正和注释，且TLI使用的专用培养皿较常规培养皿昂贵，因此TLI的使用增加了时间和经济成本。

5 结语

TLI培养系统提供了先进的胚胎培养和观察体系，能获得大量的胚胎形态动力学参数，是一种新的无创胚胎培养与实时观察技术，能够帮助胚胎学家更加精确地选择具有发育潜能的胚胎，是今后观察、预测胚胎发育潜能和非整倍性的趋势。但截至目前，尚没有统一的关于TLI用于胚胎选择的参数模型，因此，需要更多研究进行参数的探讨和胚胎选择模型的建立。基于人工智能的自动化TLI将会是未来的发展方向，其能极大地提高胚胎学家效率的同时减少人为误差。