新生儿溶血病产前诊断的研究现状和进展

刘榕孜 综述，刘 峰 审校

广西医科大学第一附属医院输血科，广西南宁 530021

胎儿及新生儿溶血病(HDFN)是指因母婴血型不合，母体天然存在或经输血、妊娠等后天免疫刺激产生的针对胎儿红细胞血型抗原的抗体，经胎盘进入胎儿血液循环，导致胎儿或新生儿同种免疫性溶血[1-2]，轻者可出现贫血、水肿、肝脾肿大，重者可能导致胎儿早期流产、胎儿发育停止和死亡，出生后的新生儿亦可以出现严重的核黄疸甚至死亡[1]。考虑到HDFN的发病会贯穿整个妊娠过程，因此，如何尽早且精准地筛查出具有高风险的HDFN妊娠事件，实施科学有效的妊娠监管以保护胎儿顺利生长发育，实现优生优育，仍是当前该领域研究的主流和热点。

1 HDFN的分类

临床上依据致病性血型抗体的不同，通常可分为ABO-HDFN和非ABO-HDFN：(1)ABO-HDFN 多发生于血型为O型的母亲，因其体内天然存在IgG抗A及抗B，而胎儿遗传了父系的A或B基因后可表达出相应的A或B型抗原，母体IgG抗A和/或抗B透过胎盘后攻击表达A/B抗原的胎儿红细胞以及组织细胞，导致ABO-HDFN发病。目前国内以ABO血型不合引起的HDFN多见。ABO-HDFN在母亲首次怀孕即可发生。(2)非ABO-HDFN 除了输血导致孕妇产生相应的非抗A/B即意外抗体产生外，孕妇在妊娠期会出现胎儿母体出血(FMH)现象，胎儿红细胞可进入母体血液循环后，引发母体非ABO血型抗原同种免疫，产生相应的意外抗体，最常见于抗Rh抗体[3]，临床上非ABO-HDFN以Rh-HDFN常见。Rh阴性女性首次怀孕Rh阳性胎儿时，通常产生IgM抗体，不能穿过胎盘导致胎儿溶血；而再次怀孕Rh阳性胎儿时，母体则会迅速产生IgG 抗体，其能有效穿过胎盘导致胎儿溶血反应[3]。MNS、Kell、Kidd及 Duffy等其他血型系统不合亦可引起HDFN[4-5]。

2 红细胞同种抗体特异性与HDFN发病风险、严重程度的相关性

发生HDFN的风险取决于几个因素：红细胞同种异体抗体的特异性、所涉及的血型抗原在胎儿红细胞的表达水平等[2]。ABO血型系统中，抗A/B抗体是临床上常见导致HDFN发病的原因，疾病多为轻度[6]。Rh血型系统中，抗D/C/c/E/e/G/CW/hrS/hrB/Ew/Goa/Rh32/Bea/Evans/Tark等抗体与HDFN发病相关，严重者可导致胎儿死亡[6-7]。MNS血型系统中，抗M/S/s/U/Ena/Mia/Mur/Vw抗体与HDFN发病相关，其中抗M/Mia/Mur/Vw抗体可导致严重HDFN[6]。P1PK血型系统HDFN发病风险低，但抗PP1PK抗体(特别是抗P成分)与早期自然流产有关[6-8]。Kell血型系统中，所有的抗Kell抗体都可能导致HDFN，如抗K/k/Kpa/Kpb/Jsa/Jsb/Ula/KEL5/KEL11/KEL18/KEL22/KEL28抗体等，同时该抗体可通过抑制胎儿红细胞生成导致胎儿贫血[6]。Duffy血型系统中，抗Fya/Fyb抗体与HDFN发病相关[6]。Kidd血型系统中，抗Jka/Jkb抗体与HDFN发病相关[6]。Diego血型系统中，抗Dia/Dib/Wra/ELO抗体与HDFN发病相关，其中抗Dia/Wra/ELO抗体可导致严重HDFN[6]。JR血型系统中，抗Jra抗体与严重的HDFN有关[9]。LAN血型系统中，抗LAN抗体多导致轻度HDFN[11]。国际输血学会(ISBT) 200系列，抗i抗体可引起轻度HDFN，其机制是母体自身抗i抗体可穿过胎盘，从而导致新生儿轻度黄疸[10]。ISBT 700系列，抗Bi/Rea/Lia/Kg/JONES/HJK/HOFM/REIT抗体与HDFN发病相关[10]。ISBT 901系列，抗MAM抗体与HDFN发病相关[10]。考虑到众多的致病性血型抗体均可导致HDFN，临床上如何提高抗体检出率和准确性，对于明确HDFN的诊断及后续的治疗至关重要。

3 妊娠期红细胞同种抗体的诊断策略

3.1ABO-HDFN的诊断策略 当前常规的试验诊断策略是依据孕妇及配偶ABO血型组合及相应妊娠期IgG抗A/B的效价测定。IgG抗A/B是衡量ABO-HDFN发病风险高低的重要因素，但其是否能成为致病性抗体，必须要以真实存在母婴血型不合即胎儿及新生儿上表达对应阳性ABO抗原作为发病基础。2021年国内专家共识针对ABO-HDFN产前监测仍以亲代血型表型不合结合IgG抗A/B的效价为主要临床风险预测的技术手段[1]。

3.2非ABO-HDFN的诊断策略 国内有研究报道关于抗D效价与HDFN发病率的统计分析结果显示：IgG抗D效价<16，发病率5.40%(低风险)；16≤IgG抗D效价<32，发病率33.33%(中等风险)；32≤IgG抗D效价<64，发病率81.81%(高风险)；64≤IgG抗D效价<128，发病率92.11%(高风险)；128≤IgG抗D效价<256，发病率95.65%(高风险)；IgG抗D效价≥256，发病率100.00%(高风险)[11]。值得说明的是，部分临床医生在妊娠管理时比对过孕妇及配偶双方血型结果后会直接开具检测某一稀有血型抗体效价测定，这其实是不严谨的，科学的诊断策略是首先通过意外抗体筛查和鉴定试验明确诊断出血型抗体类型后后方能对其进行效价的测定。因此，血型意外抗体的实际检出率成为制约致病性抗体诊断及非ABO-HDFN诊断的重要因素。一方面，当前国内外大多数实验室采用8～16人份不等的商品化的抗体鉴定谱细胞，然而不同厂家的谱细胞覆盖血型抗原的种类和纯杂合子特征差异非常大，同时复杂的抗体鉴定过程中通常还需要联合复杂的血型血清学技术，甚至血型基因分型才能做到精准的抗体鉴定，因此对鉴定人员的理论知识和技术水平要求非常高。另一方面，许多稀有血型表型诊断的抗体试剂因为价格昂贵、极难甚至无法获得商品化的试剂，因此，很多文献报道的非ABO-HDFN的血型诊断都需要对孕妇、配偶和新生儿进行基因分型鉴定，这也导致这些非ABO-HDFN在常规和基层医院的实验室无法开展，客观上也弱化了基层医疗机构对非ABO-HDFN的认识、有效妊娠管理和精确诊断。

4 妊娠期无创产前诊断技术研究进展

针对高危孕妇，早期的产前诊断为有创诊断，即通过羊膜腔穿刺术、绒毛膜绒毛穿刺术和经阴道灌洗术等获取到胎儿标本进行血型基因分型。羊膜腔穿刺术可导致自发性流产和羊水渗漏[14]。侵入性操作都会增加FMH的风险，导致同种免疫发生并产生抗体[15]。因此，非侵入性检测技术成为目前研究热点。

4.1胎儿游离DNA(cff-DNA)

4.1.1cff-DNA在预测胎儿血型中的运用 妊娠期母体血浆中可检测到cff-DNA，cff-DNA来源于滋养细胞，滋养细胞通过胎盘转移，发生凋亡，释放DNA进入母体[16]。cff-DNA在妊娠早期占母体血浆DNA水平约为3.40%，在孕晚期约占6.20%[17]。目前胎儿基因分型技术已广泛应用于胎儿ABO、Rh血型筛查、性别连锁疾病和染色体非整倍体诊断等[18]。我国已有使用cff-DNA技术报道，马红丽等[19]报道利用PCR-RFLP技术建立从O型孕妇外周血中提取DNA检测胎儿血型的实验方法，39例新生儿出生前后血型检测符合率为94.24%，孕中期血型检测符合率为91.95%，孕晚期的血型检测符合率为98.00%。于洋等[20]使用从孕妇外周血中分离胎儿ABO血型基因DNA，运用PCR-SSP技术进行胎儿血型基因型鉴定，预测胎儿的ABO血型表型，符合率为100.00%。马玲等[21]使用用Y染色体相关基因(SRY)及甲基化表观遗传标志RASSF1A作为胎儿DNA内参基因，运用PCR-SSP及实时荧光PCR技术在O型孕妇外周血浆中检测胎儿ABO基因型，其预测胎儿血型与胎儿出生后ABO血型表型一致。对于存在抗D的RhD阴性母亲，采用RhD杂合子检测和cff-DNA技术检测胎儿RhD基因型，对高风险的Rh血型不合的HDFN进行早期干预，如注射抗-D免疫球蛋白[22]。

4.1.2运用血型基因检测技术应注意的问题 目前确认了43个血型系统，抗原数345个，继PCR检测血型技术以来，二代测序成为新型检测手段，具有高通量、自动化的显著特征，但二代测序存在假阳性的问题。由于血型抗原基因多态性，基因检测技术仍面临特异性引物设计困难。如MNS血型系统糖蛋白A、B和E(分别为GPA、GPB和GPE)的基因包含跨越前四个外显子9～15的高度同源区域[23]。外显子碱基互换、内含子碱基互换、单碱基突变、不同血型糖蛋白基因在序列各个部分之间的交换等都可导致新抗原的出现。同时，基因重排可能会影响引物序列，使引物不表达，导致假阴性。胎儿遗传的部分D或弱D表型可导致RhD假阴性[17]，RhD阴性男性胎儿的Y染色体基因序列(SRY、DBY和TTTY2)、短串联重复序列和低甲基化启动子序列等内参基因可有效地用作胎儿内部标记[17]。有观点认为，基于RT-PCR的胎儿RhD检测分析应重复多次，至少两个RhD特异性外显子引物(最常见的外显子5、7和/或10)进行3次重复，可提高检测的准确性[17]。另一方面，cff-DNA在母体循环中数量低，且标本采集、运输、储存和处理过程中，母体血细胞裂解、释放的DNA不断增加，使循环中胎儿DNA被稀释。血浆DNA酶降解胎儿DNA，使胎儿血浆DNA高度碎片化。另外，标本中大量的母体DNA使胎儿DNA分析更加困难。低水平的cff-DNA可导致RhD假阴性[17]，因此，取样后6 h内处理标本，可有效提高检出效率。

4.1.3血型表型与基因型可能存在的差异 HDFN发病前提是以表型的抗原抗体为基础。ABO血型与H血型有密切关系，孟买血型是H基因突变的结果，因其上位效应影响ABO基因产物，造成了ABO血型异常表现[24]。因此，进行ABO血型基因分型时，应加做H基因检测以提高表型预测的准确率。RhAG 蛋白虽然自身不产生抗原，但是它可以辅助RhD及RhCE 蛋白锚定在红细胞膜上，形成Rh蛋白复合体，并且参与RhD抗原的缺失和表达[25]。因此，在进行RhD/RhCE基因检测时，也要进行RhAG基因检测。

4.2大脑中动脉收缩期峰值流速(MCA-PSV) 其他非侵入性诊断技术如胎儿MCA-PSV，通过MCA-PSV测量更准确评估胎儿贫血。2021年专家共识提出[1]：IgG抗体效价明显升高时，采用多普勒超声技术进行胎儿MCA-PSV测定，根据胎儿贫血的病理生理改变，包括胎儿形态学及血流动力学变化有效监测胎儿贫血程度，当MCA-PSV>1.5 MoM(中位数)时，即需要进行临床干预。

5 小 结

综上所述，HDFN是一种多层面疾病，不能简单依赖抗体为主的当前诊断策略，一方面需要提高致病性抗体鉴定的技术条件和水平，另一方面还是需要扩大孕妇及配偶的血型鉴定，尤其是当稀有血型表型诊断存在困难时，可以充分利用血型基因分型技术进行产前诊断，对于存在高风险的孕妇则可以利用母体血浆cff-DNA实现早期诊断母婴血型不合是否存在及类型，同时动态评估致病性抗体的效价及危害程度，才能在真实意义上实现血型不合HDFN的早期诊断和精准的妊娠管理。