骨髓间充质干细胞与CD133+肾脏细胞治疗急性肾损伤的机制研究

黄远航，范立明，黄盈，童若宇，申萌，周淑珍，李璟，丁遂碧

(中国人民解放军南部战区总医院肾脏病科，广东 广州 510010)

急性肾损伤(Acute kidney injury, AKI)是指由于多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征[1]。可发生于既往无肾脏病者，也可发生在原有慢性肾脏病的基础上。若不及时给予针对性治疗，会导致肾功能衰竭，对患者生命造成严重威胁[2]。目前有关AKI尚未特定的治疗，相关研究证实，抗氧化剂、利尿剂等多种药物治疗可预防性的改善AKI患者症状，但治疗效果仍无法令人满意，其死亡率仍居高不下，且预后较差[3]。

既往研究显示，肾脏损伤后的修复、再生有多种干细胞参与，其中以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)、肾脏MSCs研究报道较多见，在治疗AKI上具有一定疗效[4-5]。然而有关两者对AKI修复作用的大小尚未清楚。故本组就MSCs与CD133+肾脏细胞治疗急性肾损伤的机制进行了研究，以此为临床治疗AKI提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

选取由山东大学医学院实验动物中心提供的6～8周龄雄性C57 BL/6小鼠作为实验对象，共48只，体质量(20.01±2.24)g。根据不同的治疗方案将48只小鼠分为正常对照组、缺血再灌注损伤(I/R)组、I/R+MSCs组及I/R+CD133+组4组，每组12只。本次实验经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1骨髓MSCs、肾脏MSCs的制备 本研究48只C57 BL/6小鼠(湖北贝恩特生物科技有限公司)骨髓MSCs分离采用Percoll密度梯度离心法结合贴壁分离法。随后采用F12-DMEM细胞培养(购自美国Hyclone公司)基进行培养。当细胞生长到80 %～90 %融合时，用0.25%胰酶消化，进行传代培养，收集足够数量的细胞以备后续使用。取第3代细胞，0.05%胰酶消化成单细胞悬液，PBS 洗涤2次，分别加入荧光标记的间充质标志物CD29、CD90 以及血源性标志物CD34、CD45的流式抗体,4 C孵育30 min, PBS 洗去未标记的抗体，1%多聚甲醛固定后应用流式细胞仪检测。

CD133+肾脏细胞分离采用免疫磁珠筛选法结合贴壁分离法，将分离出的CD133+肾脏细胞进行培养。当细胞生长到80%～90% 融合时，进行传代培养，收集足够数量的细胞备用。用免疫荧光法测定其有无表达。

1.2.2不同组别治疗方法 4组均进行常规麻醉，麻醉药物：2%戊巴比妥钠溶液；打开腹腔，用不同的方法对暴露肾蒂进行处理。(1)正常对照组：肾蒂暴露10 min，将腹腔关闭，即刻尾静脉注射生理盐水，注射剂量0.2 mL；(2)I/R组：双侧肾蒂用动脉夹夹闭10 min，随后松开，将腹腔关闭，即刻尾静脉注射生理盐水，注射剂量0.2 mL；(3)I/R+MSCs组：双侧肾蒂用动脉夹夹闭10 min，随后松开，将腹腔关闭，分别即刻尾静脉注射0.2 mL含有 约2×106个MSCs的PBS溶液(购自武汉博士德生物工程有限公司)；(4)I/R+CD133+组：双侧肾蒂用动脉夹夹闭10 min，随后松开，将腹腔关闭，分别即刻尾静脉注射0.2 mL含有 约2×106个MSCs的CD133+肾脏细胞溶液。4组小鼠在同一环境下喂养，自由饮食。

1.2.3术后处理 在模型建立的第1、2、4、8 d分别处死部分小鼠(每次每组均处死3只)，采用无菌注射器进行心脏穿刺抽血，随后离心，保留血清，-20 ℃低温保存备用。获取肾脏组织，制作病理切片。

1.3 观察指标

比较各组小鼠术后不同时间点血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)与肌酐(creatinine，Cr)水平；检测方法：采用Beckman 自动生化仪检测；对病理切片进行急性肾小管坏死评分，计算其平均值，作为肾小管坏死的评分指数(ATN评分)，随后比较各组不同时间点ATN评分；比较各组小鼠术后不同时间点肾组织匀浆中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、肝细胞生长因子(hepatocyte grow th factor, HGF)、骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)的浓度。检测方法上述因子均采用酶联免疫法进行检测，检测试剂盒购自上海钰森公司。每只小鼠均从左肾取80 mg置于研磨器中，加入1 mlPBS，随后研磨至无肉眼可见的组织块。将匀浆移入1.5 ml离心管，1500 g离心5 min，取上清，移入另一个离心管，进行检测。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 骨髓MSCs与CD133+肾脏细胞培养结果

经分离培养后，骨髓MSCs在培养皿中呈梭形(见图1)；CD133+肾脏细胞经免疫荧光法检测，结果显示细胞呈现绿色荧光(见图2)。

图1 传代培养的骨髓MSCs(400×)

图2 CD133+肾脏细胞(400×)

2.2 各组小鼠术后不同时点BUN、Cr水平比较

I/R+MSCs组、I/R+CD133+组术后BUN、Cr水平均显著高于正常对照组；术后4、7 d的BUN、Cr水平均低于I/R组，其中I/R+MSCs组以术后8 d最为显著(P<0.05)；I/R+CD133+组以术后4 d最为显著(P<0.05)。详情见表1。

表1 各组小鼠术后不同时点BUN、Cr水平比较

2.3 各组小鼠术后不同时点ATN评分比较

I/R+MSCs组、I/R+CD133+组术后ATN评分均显著高于正常对照组；术后2、4、7 d的ATN评分均低于I/R组，I/R+MSCs组与I/R+CD133+组术后不同时点ATN评分比较，I/R+CD133+组术后不同时点ATN评分均略低于I/R+MSCs组，但组间比较无差异(P>0.05)。详情见表2。

表3 各组小鼠术后不同时点ATN评分比较

2.4 各组小鼠术后TNF-α、IL-10、HGF、BMP-7水平变化情况比较

I/R+MSCs组、I/R+CD133+组术后TNF-α水平均显著高于正常对照组术后，低于I/R组(P<0.05)；术后2、4、8 d I/R+MSCs组、I/R+CD133+组TNF-α水平有所下降，但仍高于正常对照组，低于I/R组。详情见表3。

表3 各组小鼠术后不同时点TNF-α水平比较

I/R+MSCs组、I/R+CD133+组术后IL-10、HGF、BMP-7水平均低于正常对照组，高于I/R组(P<0.05)；术后2、4、8 d I/R+MSCs组、I/R+CD133+组IL-10、HGF、BMP-7水平有所上升，但仍低于正常对照组，高于I/R组。详情见表4、5、6。

图3 各组小鼠术后不同时点ATN评分情况

表4 各组小鼠术后不同时点IL-10水平比较

表5 各组小鼠术后不同时点HGF水平比较

表6 各组小鼠术后不同时点BMP-7水平比较

3 讨 论

AKI是临床上常见的一种疾病，发病率呈逐渐上升趋势，且死亡率高，预后不佳[6]。目前有关干细胞治疗AKI的报道最多的是骨髓、肾脏MSCs。骨髓MSCs是在骨髓中发现的一种起源于胚胎中胚层，具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞，对骨髓造血干细胞起支持、诱导作用[7-8]。其次因骨髓MSCs易于提取和体外培养、免疫原性和成瘤性低等特点，使其在临床治疗AKI与实验研究等方面优势更大[9]。国外大量研究发现，使用MSCs治疗AKI安全可靠，且效果良好，可有效减轻患者肾功能损伤，促进肾功能恢复[10-11]。

肾脏MSCs主要来源于人体后肾间质，在成人肾脏中可长时间不进行有丝分裂，但在适当环境下可快速进行大量分裂繁殖，且可分化为成熟细胞，具有干细胞的多功能性及自我更新性[12-13]。Der Sarkissian S[14]等报道发现，在成年人肾小囊、肾小管及间质中，有少量细胞表达内皮祖细胞表面抗原CD133(CD133 +细胞)。CD133 +细胞可表达其他干细胞标志物，而且在一定条件下可形成肾小管样结构。所以，有部分学者将CD133 作为肾脏干细胞的标志物。另外大量文献报道指出CD133+肾脏细胞在肾脏损伤后的修复过程中具有重要作用[15]。

本组研究结果发现，CD133+肾脏细胞在AKI修复过程中的作用较骨髓MSCs更为明显，分析其原因可能与干细胞所处环境有关。干细胞的正常存在、自我更新及其分化能力均与其所处的微环境有关[16]。Johnson A K[17]等研究认为，MSCs可改善急性肾损伤，可能是因为其可直接分化为肾小管上皮细胞。但Liu N[18]等研究发现，MSCs直接分化呈肾小管上皮细胞的百分率极低。这表明。肾脏损伤后的微环境并不利于分化、增殖成正常肾小管细胞，而是通过其他途径修复肾脏损伤。Sun B[19]等研究认为，骨髓MSCs主要是通过调控细胞因子水平，抑制炎症细胞浸润、受损细胞的坏死与凋亡，同时使残留的上皮细胞分化成具有分裂功能的细胞，再进行分化、增殖成成熟细胞，从而改善局部肾功能。而CD133+肾脏细胞在肾脏损伤后，可增殖、分化呈肾小管上皮细胞。其次，在肾脏损伤过程中常伴有局部微血管损伤，而CD133+细胞可形成毛细血管样结果，可为肾脏修复提供营养需求[20]。此外，CD133+细胞也可通过调控细胞因子，促进肾小管上皮细胞、内皮细胞的修复，进而修复肾损伤。本组研究通过比较各组TNF-α、IL-10、HGF、BMP-7水平发现，与I/R组比较，I/R+MSCs组、I/R+CD133+组TNF-α水平明显下降，IL-10、HGF、BMP-7水平明显上升(P<0.05)，说明骨髓MSCs、CD133+肾脏细胞可调控小鼠组织中的炎症细胞因子水平，减少炎症细胞因子对肾脏的继续损伤。推测其原因可能是骨髓MSCs、CD133+肾脏细胞通过旁分泌机制，调控部分细胞因子的水平，抑制炎症细胞的浸润，抑制受损细胞的坏死与凋亡。同时，本组研究还发现，I/R+MSCs组、I/R+CD133+组术后BUN、Cr水平、ATN评分均显著高于正常对照组，其中I/R+MSCs组以术后8 d最为显著(P<0.01)；而I/R+CD133+组以术后4 d最为显著(P<0.01)，侧面表明CD133+肾脏细胞修复受损肾脏的效能比骨髓MSCs更佳。究其原因可能是由于CD133+可形成毛细血管样结构，为肾脏修复提供所需营养；另外CD133+可通过调控细胞因子促进肾小管上皮细胞、内皮细胞的修复，更有助于修复肾损伤。

综上所述，骨髓MSCs、CD133+肾脏细胞均可有效改善肾脏微环境，促进由I/R诱导的AKI恢复，但CD133+肾脏细胞对AKI的修复作用更为显著。