Lesinurad调节AMPK/mTOR抑制自噬改善高尿酸诱导的血管平滑肌异常增殖

杜丽根，余奕，蓝群盛，陈恩平，刘圣林

(1.深圳市龙岗区 第二人民医院，广东 深圳 510000；2.南昌大学 抚州医学院，江西 抚州 344099；3.深圳市龙华区 中心医院，广东 深圳 518110)

尿酸(Uric acid, UA)是嘌呤代谢的最终产物。尿酸生成过多和(或)尿酸排泄不足会引起血清尿酸水平异常升高，导致高尿酸血症(hyperuricaemia, HUA)[1]。大量研究表明高血尿酸会导致肾脏、心血管、脑血管、外周血管等靶器官产生一系列病理改变，HUA作为心血管疾病相关危险因素也日益受到医学界的关注[2]。尿酸盐转运体1(Urate transporter 1，URAT1)是负责肾脏中尿酸重吸收的主要转运蛋白，负责体内90%以上尿酸重吸收回血液，抑制其功能则有助于机体尿酸排泄，降低血尿酸水平，是目前降尿酸药物研发的热门靶点[3]。

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病，涉及多种复杂的病理过程，包括DNA损伤、线粒体功能障碍、自噬、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells ,VSMCs)的恶性增殖等[4-5]。Purnima等[6]研究认为，HUA可作为AS的重要和独立的预测因子。因此，降尿酸疗法可能在防治动脉粥样硬化中发挥积极作用。

自噬是细胞内主要的降解行为之一，其控制细胞内的细胞器和蛋白质降解，是维持细胞稳态的管家机制，也是细胞适应外源性刺激的应激和防御机制[7]。越来越多的证据表明，自噬可以调节AS的发生，对AS病变有积极或消极的影响[8-9]。研究表明，UA可以通过多种途径介导自噬，引起肾损伤、关节炎和心肌细胞的损害。如，UA通过磷酸肌醇 3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)即PI3K/AKT/mTOR通路诱发肾小管上皮细胞炎症反应，促进自噬，可被AKT抑制剂Perifosine所抑制[10]；UA可通过AMP 依赖蛋白激酶(AMP-dependentprotein kinase)AMPK/mTOR通路诱导肾小管细胞凋亡和自噬[11]；UA可通过促进AKT的表达，诱导心肌细胞自噬[12]。然而，尿酸作为有机阴离子，进入细胞必须依赖转运体的作用[13]，而URAT1是一种特异性的尿酸转运体，是否能通过抑制URAT1诱导自噬从而改善高尿酸诱导的血管平滑肌细胞损伤尚未可知。目前临床上使用的降尿酸药物Lesinurad就是特异性URAT1抑制剂，已在FDA获批与黄嘌呤氧化酶抑制剂联合用于痛风合并高尿酸血症的治疗[14-15]。因此，本文选择URAT1特异性抑制剂Lesinuard为工具药，拟探索Lesinurad对高尿酸诱导的血管平滑肌细胞损伤的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

大鼠血管平滑肌细胞A10细胞购自美国ATCC细胞库；尿酸购自上海阿拉丁生物科技有限公司；Lesinurad购自上海阿拉丁有限公司，高糖培养基(DMEM)、胎牛血清均购自Gibco公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自天根生化科技公司；URAT1抗体购自上海爱必信公司；LC3、Beclin1、p62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR抗体购自上海Abmart公司；GAPDH抗、羊抗兔二抗体购自SAB公司。

1.2 主要仪器与设备

CO2培养箱(美国Thermo公司)，低温高速离心机(美国Sigma 公司)，-80℃冰箱(美国Thermo公司)，倒置显微镜(日本Nikon公司)，酶标仪(瑞士Tecan公司)，微量电子天平(德国赛多利斯公司)，多功能成像分析系统(美国protein Simple公司)。

1.3 实验方法

1.3.1细胞培养及药物处理 对数生长期的A10细胞(第五代细胞)培养于含10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。空白对照组(control组, con group)采用等量培养基处理细胞48 h；尿酸单独处理组(UA组, UA group)采用不同浓度尿酸处理细胞48 h；Lesinurad处理组则在UA组基础上加入不同浓度药物共同处理48 h。

1.3.2CCK-8法测定细胞活力 将细胞以3×104个/ml的密度接种于96孔板，每孔100 μL，按1.2.1.中方法药物处理48 h后，每孔加入10 μL的 CCK-8，于培养箱中孵育2 h后，通过酶标仪450 nm波长检测每孔的OD值，再按公式计算出每孔的细胞活性。

1.3.3Western blot检测细胞相关蛋白表达水平 将细胞以5×105个/mL的密度接种于6孔板，每孔2 mL，按1.2.1.中方法药物处理48 h后，收集各组细胞，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转膜，封闭1 h，加入一抗(1∶1000)于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，加入二抗(1∶10000)，室温孵育2 h，加入ECL显影。成像扫描后利用Image J软件进行灰度分析。

2 结果与分析

2.1 URAT1抑制剂Lesinurad改善高尿酸诱导的A10细胞异常增殖

如图1A所示，与con组相比，不同浓度UA(300、600、900 μmol/L)刺激可引起A10细胞异常增殖，细胞活力显著增加。因900 μmol/L效果更为显著(P<0.01)，因此选择该浓度进行后续实验。加入URAT1抑制剂Lesinurad(25 μmol/L)后，高尿酸诱导的A10细胞异常增殖明显改善(P<0.01)(图1B)。

图1 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞增殖活力的影响(n=6)

2.2 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中URAT1蛋白表达的影响

通过提取大鼠血管平滑肌A10细胞的蛋白，并进行Western Blot实验检测，如图2所示，我们发现大鼠血管平滑肌细胞中存在URAT1蛋白表达，且900 μmol/L 尿酸刺激显著促进了其蛋白表达(P<0.001)，而加入Lesinurad可呈浓度依赖地减少URAT1的蛋白表达水平(P<0.01,P<0.01)，提示尿酸可能通过URAT1进入血管平滑肌细胞内，Lesinurad可通过抑制URAT1的蛋白表达，从而减少尿酸的转运。

图2 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中URAT1蛋白表达的影响(n=3)

2.3 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表达的影响

如图3所示，与空白组细胞比较，900 μmol/L UA显著诱导A10细胞发生自噬，使LC3-II/LC3-I(P<0.001)与Beclin-1(P<0.001)蛋白表达水平显著上调，p62(P<0.001)表达水平显著下调，而加入低、高剂量Lesinurad呈浓度依赖性地促进LC3-II/LC3-I(P<0.05,P<0.001)与Beclin-1(P<0.001,P<0.001)蛋白表达水平，以及促进p62蛋白表达增加(P<0.01,P<0.001)，即Lesinurad可明显抑制UA所引起的自噬，使上述蛋白表达恢复至正常水平。

图3 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表达的影响(n=3)

2.4 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中p-AMPK、p-mTOR蛋白表达的影响

结果如图4所示，与空白组细胞比较，900 μmol/L UA处理组中AMPK的磷酸化水平显著升高(P<0.05)，而mTOR的磷酸化水平则被显著抑制(P<0.05)。与UA处理组比较，Lesinurad低、高剂量显著地逆转了UA引起的p-AMPK(P<0.01,P<0.001)、p-mTOR(P<0.05,P<0.01)的蛋白表达水平，使其恢复到正常水平，说明高UA引起的自噬可能通过AMPK/m-TOR信号通路介导。

图4 Lesinurad对高尿酸刺激A10细胞中AMPK/mTOR信号通路的影响(n=3)

3 讨 论

AS是一种发生在动脉血管上的慢性进展性疾病。血管平滑肌细胞作为血管壁主要组成成份，负责维持血管壁张力及血管的完整性。血管平滑肌细胞的增殖是 AS 发展的重要生物学过程[16]。尽管当前他汀类药物和其他预防措施如减重、控糖、降压等在阻止动脉粥样硬化心血管疾病的流行上取得明显成效，但 AS仍是一种具有高发病率和高死亡率的血管疾病，新的补充与替代疗法亟待探索[17-18]。

大量研究表明，高尿酸血症与心血管疾病患者的活动能力和死亡率密切相关，降低血尿酸水平可以减缓心血管疾病的进展[19]。最近一项研究发现，高水平尿酸通过靶向NRF2介导自噬功能障碍和铁死亡来促进AS的发生[20]。而URAT1作为体内特异性的尿酸转运蛋白在维持体内尿酸稳态中发挥重要作用[21]，在心血管疾病研究中，有研究发现URAT1在血管内皮细胞中表达，介导了高尿酸导致的血管内皮损伤[22]，但抑制URAT1是否能抑制血管平滑肌细胞异常增殖而改善AS的作用尚未可知。本研究发现，高尿酸可引起A10细胞增殖能力增加，而URAT1抑制剂Lesinurad可抑制A10细胞的增殖。

自噬是维持细胞稳态的一种分解代谢过程，它复杂地参与了饥饿期间营养物质的代谢、细胞内货物的流动，并介导细胞的生命和死亡[7]。越来越多的证据表明，自噬可以调节动脉粥样硬化的过程，特别是血管平滑肌细胞的异常增殖导致血管重塑在心血管疾病的发生发展中发挥关键的作用[23]。本研究发现，高尿酸可引起自噬相关标志物LC3、Beclin-1的蛋白表达增加，以及抑制了p62蛋白的表达，说明高尿酸促进自噬发生。同时，当给予URAT1抑制剂Lesinurad可以减轻自噬的发生，更加说明UA高尿酸引起的A10细胞增殖可能与细胞自噬发生有关。

自噬的调节是一个复杂的过程，这其中涉及多种信号通路和蛋白质分子的变化，主要包括：PI3K/AKT/mTOR信号通路、AMPK/mTOR 等信号通路，同时也是调节细胞增殖的重要信号通路[24]。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是协调生理和压力条件下细胞代谢生长与自噬平衡的关键组成部分，其上游AMPK作为能量感受信号的中继站，可将细胞内的能量信号汇聚至mTOR，p-AMPK可以通过抑制mTOR磷酸化，继而增强自噬[25]。本研究结果发现，UA会增加AMPK的磷酸化，同时也抑制了mTOR的磷酸化，URAT1抑制剂Lesinrurad可逆转AMPK/mTOR的磷酸化程度。有研究发现，尿酸还会通过AMPK/mTOR/ROS途径介导了炎症反应影响AS的发生[26, 27]。所以，尿酸可能调节AMPK/mTOR信号通路介导了血管平滑肌细胞自噬的发生，从而引起血管平滑肌的异常增殖，最终导致AS的发生，但AMPK/mTOR信号通路在UA引起血管平滑肌细胞自噬的具体作用机制仍需要进一步的验证。

综上所述，本研究发现URAT1抑制剂Lesinrurad可降低尿酸诱导的A10细胞的异常增殖，其机制与介导AMPK/mTOR通路从而下调自噬水平有关。同时，本研究也为防治AS提供了新的靶点和思路，但URAT1在AS的具体作用机制还需更进一步的研究。