Caspase-8：细胞焦亡研究中的新靶点*

何思, 孟琼

广东省第二人民医院儿科(广东广州 510310)

尽管当前的早产儿救治技术不断提高，但早产儿的常见并发症，如支气管肺发育不良(bonchopulmonary dysplasia,BPD)、新生儿坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)、颅内出血(intracranial hemorrhage)、败血症(sepsis)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)等疾病的发生率并没有下降，反而因早产儿存活率的升高呈现出上升趋势[1]。根据Bell等[2]的调查显示：2013—2018年，19家美国学术医疗中心出生并接受治疗的极早产儿中，78.3%的婴儿存活到出院，明显高于2008—2012年出生的婴儿，但8.9%(890/9 956)的婴儿有NEC，2.4%(238/9 957)有早发感染，19.9%(1 911/9 610)有晚发感染，14.3%(1 386/9 705)发生了严重的颅内出血，12.8%(1 099/8 585)患有严重的ROP，重度BPD发生率高达8.0%(666/8 305)。中国的一项队列研究亦发现：全国25个省的57个三级医院新生儿重症监护病房在2019年1月1日至12月31日期间出生的所有胎龄<32周的早产儿，BPD发生率高达29.2%(2 379/8 148)，严重脑室内出血或脑室周围白质软化发生率达到10.4%(745/7 189)，NEC发生率4.9%(403/8 171)，败血症发生率9.4%(764/8 171)，ROP发生率4.3%(296/6 851)[3]。多年来，尽管国内外的学者及医疗团队积极探索研究早产儿相关并发症的预防、治疗方法，但至今仍无特异性的预防或治疗方案可以有效减少这些并发症的发生，探究疾病的发病机制，成为了近年来医学研究员的基础研究热点。新近研究发现，Caspase-8不仅可以介导细胞凋亡(apoptosis)、细胞坏死(necroptosis)的发生，还可以引发细胞焦亡(pyroptosis)，成为细胞焦亡研究中的新靶点[4-5]。

1 细胞焦亡概述

细胞焦亡是由Cookson和Brennan首次提出的一种不同于细胞凋亡的细胞程序性裂解死亡方式[6]。当细胞焦亡发生时，细胞膜破裂，细胞肿胀、染色质凝聚、细胞内的物质释放并募集更多的炎症因子从而扩大炎症反应，引起机体损伤。但与细胞坏死不同，细胞焦亡发生时细胞核及线粒体的完整性没有破坏[7]。根据发生机制和信号通路的不同，细胞焦亡可以分为经典细胞焦亡途径和非经典细胞焦亡途径。

1.1 经典细胞焦亡途径 经典细胞焦亡途径是机体一系列炎症小体的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别检测到入侵机体的病原微生物信号(PAMPs)或内环境失调而释放的细胞内源性损伤相关分子(DAMPs)后活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1前体蛋白(ProCaspase-1)[8]，激活的Caspase-1促进炎性因子生成、释放，并能裂解GaserminD(GSDMD)从而诱导细胞膜孔隙开放，细胞内的物质得以释放至胞外并引发、扩大炎症反应[9-11]。炎症小体是一种细胞内多聚蛋白复合物，由PRRs、凋亡相关斑点样蛋白(associated speck-like protein containing CARD, ASC)和效应蛋白Caspase-1组成。PRRs根据组分又可以分为NLR家族(如NLRP1、NLRP3等)和黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)等[12-15]。ASC作为衔接蛋白，具有Caspase募集激活结构域(caspase recruitdomain, CARD)，可以与Pro-Caspase-1结合并将无活性的Pro-Caspase-1活化成具有活性的Caspase-1[16]。激活的Caspase-1不仅可以切割下游炎性细胞因子前体如白细胞介素-1β前体(ProIL-1β)、白细胞介素-18前体(ProIL-18)，将其转化为生物活性细胞因子IL-1β和IL-18[17]，还会诱导GSDMD的裂解使得细胞膜形成孔隙，使得炎性因子释放至细胞外引起级联式的炎症风暴[18-19]。

1.2 非经典细胞焦亡途径 非经典细胞焦亡由人类的Caspase-4/5和小鼠的Caspase-11介导[20-23]。Caspase-4/5/11的CARD不仅可以直接识别细菌脂多糖(LPS)并诱导其寡聚化[24]，也可以直接切割GSDMD，从而诱导细胞膜孔隙的形成，释放IL-1α，导致细胞焦亡。但Caspase-4/5/11所介导的细胞焦亡对IL-1β和IL-18的活化生成无促进作用[25]。

2 细胞焦亡基础研究中的新进展

研究证实细胞焦亡可以帮助机体消除病原体防止感染，但Caspase的过度活化和持续进行的炎症反应又会引起机体的损伤[26-27]。过去的研究已经证明细胞焦亡参与了早产儿相关的NEC[28]、ROP[29]、颅内出血[30]及败血症[31-32]等疾病的发生发展，Caspase-1抑制剂的临床实验也已经得到了开展[33-34]，但到目前为止，市场上依然没有被批准用于临床治疗的Caspase-1抑制剂药物[35]。细胞焦亡的信号通路错综复杂，而最近的一项实验表明：Caspase-8可介导一个独立于 Caspase-1和Caspase-4/5/11的替代途径而激活细胞焦亡[36]。这为研究细胞焦亡的发生机制及信号通路提出一个新靶点——Caspase-8。

3 Caspase-8

3.1 Caspase家族分类 Caspase是一组结构相似但效应机制不同的的炎性蛋白酶[37]，以无活性的酶原形式(Procaspase)在体内正常细胞中表达，只有在转化成具有活性的状态后才能发挥其效应。根据参与的信号通路和发挥效应机制，可以将Caspase家族分为以Caspase-3为代表的凋亡型半胱氨酸蛋白酶和以 Caspase-1/4/5为代表的焦亡型半胱氨酸蛋白酶两大类。

过去的研究认为只存在细胞凋亡一种程序性细胞自动裂解死亡机制，但现在有越来越多的程序性细胞裂解死亡方式被人们熟知，包括细胞焦亡。近年来的研究证明，细胞焦亡和细胞凋亡紧密联系，并非毫无交集，二者的机制通路中存在着许多的交叉点，Caspase-8就是最早发现的不同类型细胞死亡之间的桥梁之一[38]。

3.2 Caspase-8介导细胞凋亡 细胞凋亡根据途径不同可以分为：内源性和外性细胞凋亡两大途径，但二者均需要Caspase家族成员的活化诱导。当凋亡启动蛋白催化半胱天冬酶酶原的活化级联反应后，凋亡效应蛋白开始切割细胞底物从而介导细胞凋亡的发生[39]。

外源性细胞凋亡途径的发生需要细胞表面的受体如Fas(CD95)或肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)与配体结合后形成死亡诱导信号复合体(DISC)。复合体的结构包括死亡结构域(FADD)和Caspase-8。适配器蛋白FADD由一个c末端死亡域(DD)和一个n末端死亡效应域(DED)组成。通过同型DD的相互作用，FADD被募集到死亡受体(DR)的胞内死亡域[40]。与DR结合的 FADD 诱导蛋白质发生构象改变，从而暴露DED结合 ProCaspase-8。ProCaspase-8的结构包含一个 n 端前结构域(包括两个 DEDs)、一个大的含有催化位点的蛋白酶亚基(p20/p18)、一个短连接区和一个小亚基(p12/p10)。当ProCaspase-8与FADD的DED相结合后，将会寡聚化及转化成具有活性的Caspase-8，从而启动细胞凋亡并切割裂解效应蛋白Caspase-3和Caspase-7，从而激活细胞凋亡[41]。

内源性细胞凋亡是由细胞内毒素或DNA损伤引起的细胞内稳态失调而触发。B细胞淋巴瘤-2(BCL-2)家族蛋白的寡聚化激活内在信号通路，形成细胞膜孔隙细胞，细胞色素c得以释放至细胞质中，触发凋亡小体的形成和 Caspase-3激活从而发生细胞凋亡[42]。

3.3 Caspase-8介导细胞焦亡 过去的研究一直认为Caspase-8是一类凋亡型蛋白酶，不参与细胞焦亡的发生[43]。但最新的研究显示，Caspase-8不仅可以诱导炎症小体的聚集，激活炎症因子介导细胞焦亡[44-45]，还可以抑制机体的先天免疫[4]。在正常状态下，转化生长因子激酶(TAK1)限制NLRP3炎症小体和受体相互作用蛋白1(RIPK1)的磷酸化[46-47]。而另有学者实验证明，耶尔森菌效应分子毒力蛋白YopJ与TAK1结合可以消除对RIPK1的抑制作用[48]，而激活的RIPK1将招募 FADD 和 ProCaspase8形成一个结构称为 RIPoptosome的复合物，通过自动处理加工激活 Caspase-8，被激活的Caspase-8通过切断GSDMD诱导细胞焦亡[49]。Caspase-8可以通过激活 Caspase-1引发炎性小体组装，间接产生具有生物学活性的 IL-1β[50]。Caspase-8被认为是细胞焦亡的分子开关。Schneider等[36]利用缺乏Caspase-1蛋白酶活性的基因小鼠(C284A)证明：Caspase-8在炎症小体中的激活受到GSDMD而非Caspase-1的抑制，但在Caspase-1酶活性失活的情况下，炎症小体可以更有效地激活 Caspase-8，触发与GSDMD无关的继发性细胞焦亡通路，作为释放成熟IL-1β的替代途径。

NLRP3作为一种识别受体，能够感知微生物入侵和内源性细胞损伤等危险信号，激活后与ASC形成炎症小体，导致Caspase-1的活化，释放促炎症细胞因子[51]。Stutz等[52]的实验却表明Caspase-8可以通过负性调节NLRP3的激活而减轻细胞焦亡的程度。Hayley的实验团队使用LPS刺激缺乏细胞flick样抑制蛋白(cflipl)的骨髓间充质干细胞(BMDMs)时发现，Caspase-8活性明显增强，并指出LPS引起的细胞死亡需要Caspase-8和GSDMD参与，而不是NLRP3、Caspase-1或Caspase-11的介导[53]。Demarco等[54]的研究进一步说明，GSDMD的裂解活化并不需要依赖于Caspase-1活化而通过Caspase-8介导，使机体对TNF-α的诱导作出应答，而且Caspase-8激活的GSDMD能够帮助宿主防御耶尔森菌的感染，最后还指出，GSDMD的裂解和细胞焦亡需要Caspase-8的二聚化和自动加工，无催化活性的Caspase-8无法引起GSDMD的裂解和细胞膜破裂。

4 Caspase-8在细胞焦亡研究中的展望

适度的细胞焦亡可以帮助机体及时清除感染细胞，维持细胞内环境稳定[55]，但过度的细胞焦亡会导致炎症反应加重[26]，引起细胞死亡和严重的组织和器官衰竭[56]。虽然已有研究证实，小鼠巨噬细胞暴露于 TAK1抑制剂后，Caspase-8 通过肿瘤坏死因子复合物IIb(TNF Complex, IIb)可直接切断GSDMD引发细胞焦亡，为宿主抵御耶尔森菌感染提供保护，减少细胞焦亡的程度，从而减轻肺部的炎症反应[54, 57]。但是，不同疾病状态下，不同的信号因子是如何激活Caspase-8，活化的Caspase-8又是如何介导疾病的发生、发展，这些具体的信号通路及其相关的调节效应蛋白均有待我们进一步研究阐明。

综上所述，靶向研究Caspase-8及其信号传递机制、通路效应蛋白将有助于我们进一步研究细胞焦亡的信号通路和致病机制。

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作者贡献说明：本文由何思作者进行文献检索及撰写成文，孟琼进行修改审核。