黄曲霉毒素的生物脱毒研究进展

陈 晖， 覃先武， 王 俣， 王 茜， 邓娟娟， 杜梨梨， 邓张双，2*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；2.三峡大学中国轻工业功能酵母重点实验室，湖北 宜昌 443002）

黄曲霉毒素（AFT）是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次生代谢产物（计成等，2010；Hassan等，1995）。已发现的黄曲霉毒素有20余种，均为二氢呋喃香豆素的衍生物（Hall等，1993）。由于其在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同将其分为发蓝光的B族、发绿光的G族及其衍生物（张玲玲等，2015）。已经分离鉴定出的18种AFT主要为B族和G族两大类，在动物体内代谢后能形成M1、M2及多种同源衍生物（史敦胜等，2017；赵春 霞 等，2016；Moyne等，2001；Sweeney等，1998）。

黄曲霉毒素B1（AFB1）是AFT家族中毒性最强的一种，分子结构中存在3个毒性位点（孙统政等，2021）。急性毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。致癌能力是二甲基亚硝胺的75倍、二甲基偶氨苯的900倍。AFB1在1993年被世界卫生组织列为毒物之首，2002年又被国际肿瘤研究机构（IARC）列为Ⅰ级强致癌物质（孙玲玉等，2012）。AFB1能够造成人类和动物的肝脏损伤，引起肝炎、肝硬化和肝癌等多种疾病（庞慧萍等，2019）。真菌毒素对畜禽养殖业及饲料工业的发展造成了严重的影响，在食品和饲料等行业对其含量有严格的限定（龚阿琼等，2018）。世界卫生组织规定的食品中黄曲霉毒素上限浓度为15 μg/kg，我国食品卫生标准中规定的上限浓度为20 μg/kg，欧盟规定的上限浓度为2 μg/kg（刘付香等，2010；Van Egmond等，2004）。

AFB1的化学结构稳定，在280~300℃的高温下才分解。AFB1不溶于水、石油醚和乙醚等，易溶于氯仿、甲醇和乙醇等多种极性有机溶剂（戴军，2015；Gratz等，2005）。AFB1在中性溶液中较稳定，强酸条件下稍有分解，强碱溶液中迅速分解（乔宏兴等，2017）。采用温和的理化方法较难脱除，生物脱除法因其温和、安全、高效的特点受到广泛关注和研究。本文对目前比较常见的AFB1生物脱除方法进行了综述，为饲料行业安全生产提供一定的参考。

1 AFB1的理化脱除方法

吸附法是目前饲料行业中应用较广泛、成熟且经济可行的一种脱毒方法。通过添加吸附物质，使AFB1在经过动物肠道时不被吸收直接排出体外，从而达到毒素脱除的效果。吸附剂主要依靠特异性基团或分子结构吸附毒素。李娟娟等（2009）将酵母培养提取物、水合铝硅酸盐和两者的复合物作为吸附剂的主要成分，测试其对AFB1的吸附能力。研究结果表明，水合铝硅酸盐为主要成分的吸附剂在体外试验和动物饲养试验中效果更好。关于铝硅酸盐的吸附原理，Phillips等（1995）的研究结果表明，铝硅酸盐的表面和层间结构有利于和AFB1形成螯合物。天然蒙脱石也是具有相似功能的化学吸附剂，Diaz等（2004、2002）的应用试验表明，天然蒙脱石能结合AFB1，降低牛奶中的AFB1含量，也可以添加到饲料中去除AFB1。但天然蒙脱石在应用中会影响基底营养物质，存在吸附量较少、选择性较差、发生解吸反应等问题。通过物理化学等方法得到的改性蒙脱石应用更广泛（韩露露等，2022）。除此之外，高温和辐照也是常用的物理脱除方法。高温导致的营养成分损失和辐照效果的不稳定性等缺点也对使用场景造成了一定限制。臭氧处理是近期研究较多的化学脱除方法。Sultan等（2021）对黄曲霉菌株的不同生长阶段和不同条件的臭氧处理进行了研究，发现臭氧能抑制分生孢子的萌发和AFB1的产生。除了成本因素外，臭氧处理对设备也提出了更高要求。除此之外，氨水、氨气或碱液处理也是常用的化学脱除方法，但在使用过程中需考虑环保等问题。

2 微生物对AFB1的脱毒作用

微生物对AFB1的脱毒方式主要分为吸附与降解。与理化方法相比，生物脱毒条件温和，不会破坏原料本身造成营养成分损失，也不会改变感官，影响适口性。另外添加的微生物可能作为益生菌提高产品的营养价值。整个脱毒过程不需要昂贵的设备，因此更适用于饲料等行业中的大规模应用（Fellows等，2017）。

2.1微生物对AFB1的吸附作用 除了传统的铝硅酸盐和蒙脱石等化学吸附剂以外，自然界中的某些微生物如乳酸菌和酵母菌等，由于其特殊的细胞结构，能够和AFB1形成复合体，最终被禽畜排出体外，减少对AFB1的吸收。乳酸菌细胞壁中的肽聚糖成分如N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺是吸附AFB1的主要原因（蔡俊等，2017）。酵母细胞壁富含β-葡聚糖和甘露聚糖，具有三维网络结构和形成分子间氢键的双重功能，是一种理想的霉菌毒素吸附剂，可单独使用也可与其他吸附材料联合使用（Raju等，2000）。

Magnoli等（2016）从肉鸡饲料、粪便及消化道中分离得到了9株酵母菌，通过对AFB1的吸附等温线研究，发现酵母菌对AFB1的吸附能力和菌株来源无关。如能利用肉鸡饲养环境中的天然酵母来控制家禽的慢性黄曲霉中毒将更有应用前景。随后Magnoli等（2017）通过体外试验研究了毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）对AFB1的吸附能力，发现在被100 μg/kg AFB1污染的饲料中添加0.1%的毕赤酵母能够减轻毒素对肉鸡的中毒影响。楚杰等（2013）研究了不同预处理条件、菌体浓度、处理时间、pH环境等因素对布拉酵母菌脱除AFB1效果的影响。试验中超声波、强酸和高温等预处理条件均能使菌体灭活，但对实际脱毒效果影响不大，表明其脱除AFB1的主要机理是吸附作用。另外也提到菌体脱毒率越高，水洗对脱毒效果的影响也相对较大。由于布拉酵母菌本身是一种广泛用于养殖业的益生菌，能够防治动物胃肠道疾病，结合其脱除AFB1的能力，在饲料行业将会具有良好的应用前景。张秀江等（2016）研究了主要成分为酿酒酵母和水合铝硅酸盐的吸附剂对霉变饲料中AFB1的吸附和脱除效果。体外吸附试验和蛋鸡体内吸收试验均表现出该吸附剂对AFB1（500 μg/kg）的吸附作用，其中添加0.25 mg/mL吸附剂的体外试验吸附率达98%，体内试验的吸附率达86%，表明该吸附剂可用于预防动物食用霉变饲料中毒。Zhou等（2017）从大豆酱中分离出鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）用于吸附去除霉变花生粕中的AFB1（115 μg/kg），通过单因子试验，在最优条件下AFB1去除率达到了97%。在液体发酵中，鲁氏酵母的非活细胞对AFB1的结合率最高达到了74.3%。

除酵母菌以外，乳酸菌作为另一类益生菌，其中的某些菌株也具有特异性吸附脱毒的能力。因此近年来乳酸菌在食品行业中的防霉去毒应用研究逐渐兴起。李志刚等（2003）将多种乳酸菌与AFB1振荡培养1 h和2 h后，检测细胞沉淀中AFB1的含量，Ames试验被用于检测AFB1的致突变性。试验结果显示8株乳酸菌结合AFB1的强度差异从4%到50%不等，其中干酪乳杆菌亚种CGMCC1.539吸附AFB1的能力可达到49%，AFB1被吸附后依然有致突变性的可能。Ahlberg等（2015）研究也发现，乳酸菌能够降低AFB1在食品和饲料中的毒性，同时灭活的细菌细胞相比活细胞对AFB1具有更高的结合能力。Bovo等（2014）评估了鼠李糖乳杆菌菌液和干燥细胞对AFB1的吸附能力，表明鼠李糖乳杆菌菌液和冷冻干燥的细胞具有相似的吸附能力，而喷雾干燥的细胞由于细胞壁结构和功能被破坏，几乎完全丧失了吸附能力，表明乳酸菌对AFB1的吸附作用主要取决于其细胞壁的完整性结构。Huang等（2017）从豆腐中分离得到一株植物乳杆菌C88，研究其体外的AFB1结合能力和在小鼠体内对AFB1的解毒效果。结果表明小鼠口服热杀死的C88菌体，随粪便排出的AFB1含量增加，通过调节AFB1的代谢来减轻中毒症状。

微生物与AFB1的结合往往是可逆的，可能会导致去毒不彻底、去毒周期长，同时AFB1也会随着食品和饲料的多次加工而游离出来，造成二次污染（李超波等，2012）。因此生物吸附脱毒在应用上存在一定局限性，从源头进行生物降解脱毒就显得十分重要。

2.2微生物对AFB1的降解作用 研究认为微生物在生长繁殖过程中所产生的胞外、胞内酶能将剧毒的AFB1降解为无毒或微毒产物。目前细菌降解AFB1的报道主要有假单胞菌、芽孢杆菌、分枝杆菌、橙色黄杆菌和红串红球菌等。真菌降解AFB1的报道主要有黑曲霉、白腐菌和假蜜环菌等。真菌的降解作用受周期较长、程度不一和安全性等因素限制，阻碍了其在工业和农业上的应用。Shetty等（2007）的研究发现，微生物降解AFB1的原理可能是破坏其结构中双呋喃环或内酯环单元，分子结构的改变导致毒性降低。但目前大多数具有降解AFB1能力的微生物并不是农业农村部所规定的可以在食品、饲料中允许添加的菌株，因此在应用上存在一定局限性。农业农村部允许在饲料中添加且目前研究较多的主要是芽孢杆菌属的相关菌株。

孙玲玉（2014）从泰山土壤中分离并筛选出具有降解AFB1作用的枯草芽孢杆菌，研究了该菌株的AFB1降解率、活性组分及其性质，优化了其降解AFB1的条件，并对饲料中AFB1的降解效果进行了评价。在实际应用中，该菌株能将霉变饲料的AFB1含量从60 μg/mL左右降到10 μg/mL以下。具有降解功能的活性成分可能是游离于上清液中的一种胞外分泌物。在小鼠安全性试验中，该菌株也被证明是安全的，具有在饲料或者食品行业中应用的可能性。张志敏等（2014）从秦川牛瘤胃中分离鉴定得到了一株巨大芽孢杆菌。在最适条件下接种5%，培养3 d后500 μg/mL的AFB1发酵培养基中降解率达79%，表明该菌株在饲料添加等方面有很大的应用潜力。徐铭乾等（2015）采用唯一碳源、液态发酵和固态发酵等多级筛选，得到一株能够高效降解AFB1的解淀粉芽孢杆菌。该菌株对不同AFB1含量的花生粕饲料样品降解率均达到80%以上，降解量分别能达到10 μg/kg和120 μg/kg左右。降解后的花生粕饲料样品中AFB1含量均低于30 μg/kg，符合国家限定标准。Xu等（2017）从玉米和大米等样品中分离筛选了43株细菌，其中AFB1降解能力最强的为一株沙氏芽孢杆菌。该菌株的培养基上清液相比活细胞和细胞提取物的AFB1降解能力更强（分别为77.9%、28.6%和17.2%，P<0.05），加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠后降解率从77.9%降低至15.3%，表明降解AFB1的物质可能是一种胞外酶。Zhang等（2017）从鱼的内脏中分离得到一株枯草芽孢杆菌，通过给鸭子饲喂发霉的玉米来研究该菌株对鸭子生长性能、抗氧化能力以及AFB1残留的影响。结果显示饲喂含有20 μg/kg左右AFB1的玉米会抑制鸭子的平均日增重和抗氧化能力，而在发霉玉米中添加该菌株后其各方面性能与空白对照组相似。表明枯草芽孢杆菌能缓解鸭子的中毒现象，将其作为饲料添加剂具有一定的应用价值。

具有AFB1降解能力的菌株还有很多，Lillehoj等（1967）发现，橙色黄杆菌能够去除溶液中的黄曲霉毒素。Line等（1995）通过碳标记证明了橙色黄杆菌对AFB1的去除是因为菌体代谢而非吸附作用。Sangare等（2014）分离得到一株铜绿假单胞菌N17-1，在NB培养基培养72 h，可以降解82.8%的AFB1、46.8%的AFB2和31.9%的AFM1。Eshelli等（2015）筛选发现Rhodococcus erythropolis，Streptomyces lividans和Streptomyces aureofaciens三种放线菌具有一定的AFB1降解能力。

3 AFB1生物脱毒在饲料中的应用

饲料生产和加工过程中对AFB1进行脱毒是保证人畜健康和食品安全的重要环节。目前AFB1生物降解在工业上的应用主要集中在研究和生产可降解AFB1的酶制剂或菌剂产品等。

酶制剂的应用主要是AFB1降解酶及其他复合酶，陈志敏等（2010）用AFB1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素降解复合酶直接与发霉饲料原料、浓缩饲料或全价饲料混合来进行霉菌毒素的脱毒。该方法可以去除饲料中霉菌毒素，有利于动物健康，提升经济效益。蔡俊等（2015）筛选获得了一株夏孢生枝孢，具有较强的AFB1降解酶合成能力，通过利用工农副产物或废弃物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉发酵产酶，节约生产成本。王林等（2019）基于微生物和多种酶的复合作用，提出用米曲霉和酿酒酵母的发酵混合酶制剂对霉变的粮油和饲料中的AFB1进行处理。

菌剂类产品相比酶制剂产品更方便制备和使用，常见的菌剂用微生物有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌、酿酒酵母和鲁氏接合酵母等。王旭等（2019）提供的一株溶杆菌和周育等（2019）筛选得到的一株泉水单胞菌均能同时处理AFB1和赭曲霉毒素A。尹清强等（2020）通过响应面回归设计，得出酿酒酵母、地衣芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的组合，与黑曲霉发酵产生的霉菌毒素降解酶配比，能综合处理AFB1和玉米赤霉烯酮（ZEA）。表明了微生物菌剂在饲料综合脱毒方面的应用价值。

目前，市面上也出现了一些AFB1生物脱毒产品，例如上海牧兴动物药业有限公司的产品霉敌含有AFB1解毒酶；郑州百益宝生物技术公司的产品脱霉宝含有的降解酶是一种源于毕赤酵母菌种的AFB1降解酶，同时产品中还含有枯草芽孢杆菌、酵母菌，能够增加产品的降解能力及营养成分；河南信之本公司的产品化霉净则含有灭活酵母作为AFB1脱除剂。此外，获得生产许可证的降解霉菌毒素的微生态制剂霉立解，为中国农业大学研制开发，河南亿万中元生物技术有限公司负责生产。产品主要成分为枯草芽孢杆菌及其发酵产物，经肉鸭、奶牛、肉鸡、仔猪及蛋鸡的解毒和生长促进作用试验，表明该产品具有高效降解饲料黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的功能，其中对AFB1的降解率达到了80%以上；同时能够缓解霉菌毒素对动物的危害，提高生长性能。

虽然目前已有部分AFB1生物降解产品应用于饲料行业，但由于一些微生物及其培养成分超出我国法律所允许的添加范畴，直接影响到推广应用。由于微生物酶产量低、性质不稳定、产品价格偏高且降解机理及解毒特性缺乏深入研究，导致该类产品暂时还未被大多数用户接受。因此，未来还需要开发更多高活性、低成本的新型解毒饲料添加剂。

4 结语

适宜的水分、温度、营养基质等给黄曲霉和寄生曲霉的生长提供了较好的条件。在饲料的生产、加工、储存和运输等过程中，黄曲霉繁殖产毒，不经过处理直接被动物食用后会对动物的生长性能、肝脏、免疫系统等造成影响。目前主要通过前期水分控制防止霉变及后期去毒来降低黄曲霉毒素的影响。黄曲霉毒素的去毒研究已经取得了一些成果，其中生物脱毒法是现阶段的研究热点，但目前在应用上仍然存在着一些不足。因此研究黄曲霉毒素产生的控制措施及各种脱毒技术，进一步开发能够高效降解黄曲霉毒素B1的菌种对预防和处理毒素具有积极重要的作用。