乳酸菌干燥工艺研究进展及在水产养殖上的应用

唐 辉， 徐奇友， 李爱科， 王薇薇， 陈丽仙， 乔 琳*

（1.湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000；2.国家粮食和物资储备局科学研究院粮食品质营养研究所，北京 100037）

随着大规模、集约化生态养殖模式的发展，饲用乳酸菌制剂在畜禽、水产等养殖领域作为饲料添加剂用于促进动物生长、动物疾病防治、增强动物免疫力、抑制病原菌生长、调节肠道菌群等方面，以安全、有效、无毒副作用等特点逐渐成为饲用抗生素的替代品之一（Kong等，2020）。饲用乳酸菌制剂是由乳酸菌经过发酵、浓缩、包被、干燥等过程制成的固态菌剂，饲喂动物后通过在动物消化道内的定植发挥益生功能（何江波等，2020）。然而，乳酸菌在加工、运输、储存及在动物胃肠道内的转运过程中，常常受到高温、氧化、机械、冷冻、酸、胆盐等逆境环境的影响而遭受损伤，甚至死亡，尤其在水产养殖领域，由于水产饲料在加工过程中普遍进行高温制粒或膨化，往往很难保证饲料中存在足够数量的乳酸菌来实现其益生功效（王瑞雪等，2020）。因此，目前很多学者针对提高乳酸菌存活率的干燥工艺及干燥时的损伤机制进行研究以提高饲用乳酸菌制剂的抗逆性。本文对乳酸菌制剂的干燥工艺、干燥时的损伤机制及其在水产养殖上的应用进行综述。

1 乳酸菌的干燥工艺

乳酸菌作为一类益生菌，无论是用作食品添加剂还是饲料添加剂，其发挥益生作用的基础与前提是在胃肠道中达到一定的活菌数。美国FDA推荐食品中益生菌的活菌数不低于1.0×106CFU/g或CFU/mL（Tripathi和Giri，2014）。然而，相较于芽孢杆菌、酵母菌等其他益生菌，乳酸菌的抗逆性差，在生产加工、运输储存和使用过程中十分容易失活。因此，为了生产出活菌数高、稳定性强的乳酸菌制剂，乳酸菌发酵液需经过特殊的加工处理技术，包括真空冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥等工艺。

1.1乳酸菌的真空冷冻干燥真空冷冻干燥是19世纪初出现的用于生物体脱水的技术，自1909年Shackell将其用于冻干细菌和血清后，经过上百年的发展，如今已经被广泛应用于微生物制剂的生产及保藏中，真空冷冻干燥工艺是保证乳酸菌存活率与活性的最有效的后处理方法（王威等，2016）。

其技术原理是根据水的相平衡关系：水有固、液、气三相，随着压力的降低，水的冰点变化不大，沸点却越来越低，并逐渐向冰点靠近，当压力降至一定真空度，冰点沸点重合，固态水就不经液态直接升华为气体（余淑娴等，2007）。乳酸菌的冻干就是利用这一原理，主要可分为预冻、一次干燥、二次干燥三个过程。乳酸菌发酵液通过预冷冻，细胞内外的液体冻结成固态；一次干燥除去细胞内外的自由水，二次干燥除去部分结合水，一次干燥后残余水分含量为5%，二次干燥后残余水分含量仅为1%（Assegehegn等，2019）。使用此方法所得的干燥菌粉水分含量低，微生物的代谢活动缓慢，生长繁殖受到抑制，但不会失去活力，干制品保持原有骨架结构和形态，由于干燥是在真空状态下进行，隔绝了氧气，因此一些易氧化的物质得到了保护，且冻干制品是直接由冰晶升华而制成的，因而具有多孔结构，具有理想的速溶性和迅速复水性（Ferronatto等，2021；胡方洋等，2020）。

然而，冷冻干燥可能导致细胞的膜损伤，蛋白质、DNA变性等，导致细胞活性和活力的丧失，保护剂在真空冷冻干燥过程中对保持细胞活力具有重要作用（Fonseca等，2015）。许多冷冻保护剂，如糖类、蛋白质、维生素等已被用于在冷冻干燥和随后的储存过程中尽量减少细胞活力的损失。辛国芹等（2021）使用25%脱脂奶粉、7.5%海藻糖、0.75%甘油做植物乳杆菌BLPS-9的冻干保护剂，冻干后其存活率为91.01%，冻干菌粉活菌数可达6×1011CFU/g，在4℃和-20℃条件下储存28 d后菌粉活菌数无明显损失，具有较好的应用价值。张雅硕等（2019）在优化副干酪乳杆菌的冻干保护剂过程中，以15%脱脂奶粉、20%蔗糖、7%聚乙烯吡咯烷酮、1.3%谷胱甘肽为复合保护剂，经-196℃下预冻15 min后冻干，冻干后存活率为99.8%，菌粉活菌数达到2.4×1011CFU/g，在扫描电镜下观察发现菌体结构完整、形态饱满，表明复合保护剂对细胞具有较好的保护作用。Savedboworn等（2017）使用蛋白质和海藻糖的混合物作保护剂对植物乳杆菌进行真空冷冻干燥，在-18℃条件下预冻17 h后，转入0.110 mBar、-50℃的真空冷冻干燥机中冻干18 h后，其存活率为98.13%，将冻干后菌粉在4℃条件下贮藏168 d，对其进行稳定性评估，结果表明，冻干菌粉在长期储存过程中仍保持较低含水量和较高的活菌数，含水量为2.13%，菌粉活菌数为9.22 log CFU/g。Jofré等（2015）在冻干鼠李糖乳杆菌时使用葡萄糖、乳糖、脱脂乳混合物作为冻干保护剂，冻干后其存活率高于94%，显著高于单独使用或不使用保护剂后的存活率。周佳豪等（2020）用质量分数分别为6.0%海藻糖、8.5%低聚木糖、11.5%脱脂乳粉、1.0%谷氨酸钠的混合保护剂冻干干酪乳杆菌，冻干后存活率为98.24%，显著高于未添加保护剂的菌剂存活率79.24%。

虽然真空冷冻干燥是一种常用且成熟的干燥技术，但其也有缺点，真空冷冻干燥工艺设备投资大，生产周期长，能源消耗高，是一种昂贵且分批的生产过程（Broeckx等，2016）。高昂的成本致使使用真空冷冻干燥工艺生产的乳酸菌制剂很难用于水产养殖行业。

1.2乳酸菌的喷雾干燥 喷雾干燥是通过蠕动泵将乳酸菌发酵液和载体的混合液输送到雾化器雾化成微小液滴后在干燥室高温空气的作用下快速传热传质，完成干燥并形成颗粒的过程，是一种经济、高效的菌粉生产工艺，喷雾干燥生产的菌粉流动性好、含水量低、颗粒均匀，且成本较真空冷冻干燥低4~7倍（Sosnik等，2015；Golowczyc等，2011）。

喷雾干燥过程一般可分为恒速干燥和降速干燥两个阶段：雾化的液滴与高温气流接触后，表面的水分在高温作用下，快速蒸发，由于液滴表面的水分充足，因此干燥的速率维持恒定，随着干燥的进行，液滴内溶解的溶质积累到细胞表面及细胞表面的水分的减少，水分蒸发缓慢，便进入降速干燥阶段，此过程由于细胞和高温气流直接接触，且细胞大量脱水，因此对细胞的损伤一般发生在此阶段（蒋晓莹，2019）。根据空气和液体进入干燥室的方向，可分为并流、逆流和混流三种模式，因为乳酸菌对温度很敏感，因此通常采用并流方式，即液滴和气体同时从一个方向进入干燥室，在这种模式下，最湿的液滴与最高温度接触，最干燥的颗粒与最低温度接触，从而减少温度对乳酸菌的损伤（Broeckx等，2016）。Ananta等（2005）研究表明，乳酸菌喷雾干燥后的存活率与在干燥室停留的时间和出口温度密切相关，停留时间长，出口温度高，对乳酸菌损伤大，增加进口温度能加快干燥速率从而减短停留时间，但进口温度的升高会增加温度对乳酸菌造成的损伤，因此寻找合适的进出口温度对保证乳酸菌存活率至关重要。刘博等（2017）在优化罗伊氏乳杆菌喷雾干燥条件时发现，控制出口温度为80℃时，罗伊氏乳杆菌存活率随着进口温度在110~150℃内升高而降低；控制进口温度为120℃时，罗伊氏乳杆菌的存活率随着出口温度在50~90℃内的升高而降低。熊涛等（2015）在制备植物乳杆菌NCU116发酵剂的过程中，进风温度为125℃时，干燥后菌粉存活率为89.95%，活菌数为10.96 log CFU/mL，进风温度为140℃时，存活率为60%，活菌数为9.8 log CFU/mL。

虽然喷雾干燥处理量大、成本低、效率高，但是处理温度通常都会高于70℃，导致微生物细胞受到的高温胁迫也是最大的，细胞存活率与活性会受到很大的影响。蒋艾廷等（2019）发现，在温度高于50℃时，乳酸菌的可培养性显著下降，喷雾干燥时，己糖激酶、乳酸脱氢酶、ATP酶等关键酶活性显著降低，且产酸性能下降。同时，在喷雾干燥时，菌体在高渗、氧化、机械应力逆境条件下，菌体的膜蛋白、膜脂质、甚至遗传物质DNA会遭受严重损伤，造成菌体存活率降低（王瑞雪等，2020）。此外，随着细胞在干燥室的下降及细胞表面水分的流失，细胞会直接和高温空气接触并升温直至出口温度，因此乳酸菌在干燥室的停留时间和出口温度及含水量成为影响乳酸菌干燥后存活率的重要因素。公丕民（2019）在保加利亚乳杆菌喷雾干燥的研究中发现，在出口温度为70℃时，细胞会遭受热损伤和脱水损伤，而在60℃时，细胞仅遭受脱水损伤，且随着出口温度的降低，细胞的存活率升高。同时，Gong等（2019）指出在出口温度为70℃，液滴含水量低于0.31 g/g时，保加利亚乳杆菌的存活率急速降低的原因是细胞和热空气直接接触造成的。Ananta等（2005）在喷雾干燥鼠李糖乳杆菌时发现，膜损伤是细胞死亡的主要原因，且随着出口温度的升高，膜解体程度逐渐增加。

1.3乳酸菌的流化床干燥 流化床干燥是将乳酸菌发酵液雾化喷涂到通过空气流化的固体颗粒载体上或是对含有菌体的流化固体颗粒进行干燥的一种方法（Broeckx等，2016）。干燥时可以用设定好温度的气流对物料进行干燥，温度可以根据物料性质进行调整，与喷雾干燥相比，因其温和的温度和良好的传质效率，可以实现物料在低温条件下的高效干燥，干燥的成本与喷雾干燥相当或略低于喷雾干燥，该工艺也适用于大规模连续生产，干燥时间（从1 min到2 h）比喷雾干燥长，但是热失活可以最小化，因此更适合乳酸菌等热敏物质的干燥处理（赵强强等，2020）。

Wirunpan等（2016）将乳酸杆菌1464添加到虾饲料中使用流化床工艺进行干燥，在进气温度为50℃时，饲料颗粒水分由26.5%降至11%以下仅需50 min，且进风温度越高，达到平衡含水量时间越短，在进风温度为50~80℃时相应的菌株存活率为96.87%~89.54%。Toledo等（2010）将短乳杆菌添加到鱼饲料中使用流化床工艺进行干燥，进风温度为40℃，2 mm和4 mm鱼饲料颗粒分别干燥40 min和60 min后，其含水量分别约为5%和7%，干燥后的活菌数分别为8.8、8.9 log CFU/g，在4℃条件下存储42 d后，其存活率分别为87.5%、93.26%。Mille等（2004）发现，在进气温度为35℃、空气流速为1300 L/min条件下流化床干燥30 min后，酪蛋白粉中的植物乳杆菌存活率为80%。根据Nag等（2013）的研究，流化床干燥能保持干酪乳杆菌在25℃条件下储存12周后活菌数仍保持为7.7 log CFU/g。

相比成本高昂的真空冷冻干燥及处理温度高的喷雾干燥，流化床干燥工艺成本低、温度温和、效率高，是处理乳酸菌的有效方法。然而流化床干燥也会导致菌体的死亡等应激反应，所以有必要考察流化床干燥过程中影响乳酸菌存活率和稳定性的因素，其中优化保护剂配方及干燥工艺是提高乳酸菌在流化床干燥后存活率及在逆境环境下保持稳定的有效策略。

用于乳酸菌流化床干燥的保护剂可以是单一物质，也可以是混合物。常用的保护剂主要由糖类和蛋白质构成，也可以是小分子的氨基酸、山梨醇、谷氨酸钠和抗坏血酸等相溶性介质。Strasser等（2007）在使用流化床干燥屎肠球菌时，以葡萄糖、海藻糖、蔗糖、麦芽糖糊精的混合物做保护剂，结果表明，添加保护剂的细胞干燥后存活率为70%，而不添加保护剂的细胞干燥后存活率仅为10%。Stummer等（2012）使用脱脂乳作为屎肠球菌M74的流化床干燥保护剂，发现干燥后细胞的可培养性显著高于不添加保护剂的对照组，添加100%脱脂乳后干燥细胞与新鲜细胞的可培养性无显著性差异，添加脱脂乳相比不添加脱脂乳干燥后细胞的相对PI强度和相对DHR123强度均显著降低。由此可见，添加保护剂对乳酸菌在干燥、储存时保持活性具有积极意义。

研究流化床干燥的工艺变量和工艺条件对提升乳酸菌细胞活力具有显著影响。干燥时选择合适的细胞载体、包衣材料，对流化床干燥后制剂的颗粒形状、流动性以及存活率至关重要，载体、包衣材料不规则或具有黏性会导致床层不均匀，颗粒结块及干燥速率降低，常用的流化床干燥载体材料有脱脂乳、马铃薯淀粉、藻酸盐和酪蛋白（Santivarangkna等，2010a）。此外，干燥时温度过高、较大的雾化压力及流速会造成细胞膜或蛋白质结构的破坏以及干燥不均匀甚至结块。Azim等（2012）使用流化床工艺对冻干罗伊氏乳杆菌C10菌粉使用硬脂酸进行包衣时发现，在70℃下呈熔融状态的硬脂酸以流速为40 g/min的速率传输到达喷头时，其温度往往低于熔点，硬脂酸凝固，造成管道堵塞，为了保证硬脂酸在到达喷头时，仍保持熔融状态，研究者选择在150℃条件下融化硬脂酸，同时流速增加到80 g/min以减少热量在管道内的散失，保证在到达喷头时入口温度为70℃以上，然而，随着硬脂酸包被罗伊氏乳杆菌过程的进行，硬脂酸在流化床干燥室内上层快速积累，并落到床层底部，影响下部物料的循环，最终在流化床干燥室内形成一个大团块，造成湿式死床。Bensch等（2014）将植物乳杆菌菌悬液和D-山梨醇混合后喷涂到麦芽糊精载体上，控制工艺参数为：进风温度40℃、空气流量85 kg/h、床层温度36℃、雾化压力4 Bar，虽然在干燥过程中观察到膜完整性的丧失，但仍成功制备出活菌数为2.7×109CFU/g的菌粉，可见控制流化床工艺参数对保证乳酸菌存活率的重要性。此外，干燥后的含水量也是影响乳酸菌制剂储存稳定性的关键因素，含水量5%~10%被认为是保证乳酸菌制剂稳定储存的合理范围（Toledo等，2010）。

使用流化床工艺对乳酸菌进行多层包被也是一种提高乳酸菌干燥后稳定性的有效方法。乳酸菌的包被是采用天然或合成高分子材料（壁材）将乳酸菌（芯材）包裹起来形成封闭微型胶囊的技术（纪瑞等，2018）。包被后形成的微胶囊主要有壁材完全包被芯材的储集型、芯材分散在壁材内部或表面的基质型以及包被后再包衣的涂层基质型三种类型（吴军林等，2019）。与挤压、乳化、喷雾包埋方法相比，使用流化床的工艺对乳酸菌进行包被可使制粒、干燥、包衣在一个过程中完成，包被时，芯材（添加或不添加保护剂）被置于流化床干燥器底部通有热空气的床层，并在空气作用下流化，壁材溶液则通过顶部的雾化装置喷洒到芯材上最终形成微胶囊。然而包埋形成的微胶囊，通常由于壁材与流动气流的原因，造成微胶囊结构的高孔隙率，导致细胞损伤，因此常常需对微胶囊进行包被，即双层或多层包被（Laelorspoen等，2014；Mokarram等，2009）。Pitigraisorn等（2017）使用流化床方法对嗜酸乳杆菌的海藻酸盐微胶囊使用鸡蛋蛋白和硬脂酸镁进行包衣，发现未包衣的海藻酸盐微胶囊由于水分溢出，导致结构塌陷，而包衣的胶囊则结构完整，暴露于70℃、相对湿度为100%的环境中30 min后，包衣的微胶囊菌株活性仅降低了0.6~1.3 log CFU/g，而未经过包衣的微胶囊菌株活性降低了3.3 log CFU/g。Schell和Beermann（2014）将虫胶通过流化床顶喷的方式对罗伊氏乳杆菌的甜乳清微胶囊进行包衣，发现经过包衣的微胶囊在4℃避光条件下储存28 d后菌落数显著高于未经过包衣的甜乳清微胶囊，在模拟胃肠道的条件下经过虫胶包衣的存活率为76.74%，而未经虫胶包衣的存活率仅为25%。

2 干燥对乳酸菌的损伤机制

干燥期间，乳酸菌在高温、脱水、渗透压、氧化、机械等逆境条件下会遭受损伤，对细胞的功能性结构和组分包括膜脂质、膜蛋白、酶、胞内蛋白、细胞器、遗传物质等造成不可逆改变，其中，热损伤、脱水损伤和冷冻损伤被认为是造成乳酸菌干燥时损伤的主要因素（李明慧等，2018；Peighambardoust等，2011）。

2.1热损伤 细胞内多种生物组分及亚细胞结构具有热敏性，这些组分在高温作用下变性或破坏会导致细胞代谢及生理功能紊乱，甚至死亡。Teixeira等（2010）利用DSC技术发现，在热处理保加利亚乳杆菌时，64℃以下细胞膜被破坏，65℃以上细胞壁和蛋白质等细胞组分被破坏，69℃时核糖体被破坏，90℃时DNA被破坏。而有研究者指出，DNA变性所需的温度高于杀死乳酸菌的温度，因此，具有活性的乳酸菌DNA的破坏通常不被认为由高温造成，但值得注意的是，作为合成蛋白质主要场所的核糖体在细胞内的数量通常超过10000个，其在高温作用下发生不可逆失活或破坏会直接影响细胞基因的表达，从而导致细胞功能异常或死亡（Miles，2006）。此外，高温通常会打开酶等生物大分子的高阶结构，打破单体单元间的连接，从而影响生物大分子的活性。綦晓青（2016）发现，微生物在高温下乳酸脱氢酶的活性会显著降低，而乳酸脱氢酶是催化细胞膜脂肪酸链去饱和的重要酶，可提高脂肪酸链的不饱和度，提高细胞膜的流动性，乳酸脱氢酶活性的降低，造成细胞膜流动性大大降低，对菌株造成损伤。另有研究表明高温会破坏乳酸菌细胞壁S层蛋白的结构，导致其与肽聚糖的交联受到抑制，从而影响细胞壁的生理功能（张晓宁，2019）。

2.2脱水损伤 水是维持细胞内物质分子结构稳定及细胞内生化反应的必需成分，无论采取何种方式的干燥，脱水都是造成细胞损伤和死亡的原因之一，维持细菌正常生理状态的最低水分含量是33.33%，维持乳酸菌制剂长时间储藏的基本要求是残余水分含量低于7%，水分活度低于0.25（Peighambardoust等，2011）。脱水时，细胞内含量较多的自由水的丧失对细胞的损伤较小，反而是含量较少且与胞内物质结合的结合水的丧失才是引起细胞损伤与死亡的主要原因，脱水引起的细胞损伤位点主要有细胞膜和细胞质。

细胞膜主要由磷脂双分子层构成，磷脂分子的极性头部之间通过氢键与水分子相连，各分子间通过疏水作用和范德华力维持细胞膜的结构稳定和保证流动性。当脱水时，磷脂分子极性头部之间连接的水分子被除去，导致极性头部之间出现空缺，稳定的双分子层结构被破坏，导致细胞膜由流动的液晶相转变为不流动的凝胶相，细胞膜的流动性是细胞与外界环境进行物质交换的基础，流动性的丧失导致膜上酶及转运蛋白等功能受到影响，造成细胞死亡（Shi等，2018）。

随着细胞脱水，细胞质的黏性逐渐增大，当细胞质黏度达到1014Pa/s时，细胞质会进入玻璃化状态，玻璃化是一种亚稳定状态，同时具有固体和流体的特性，这种特性有助于维持细胞内蛋白质高级结构的稳定，阻止胞内化学成分与结构的变化与扩散，遏制脱水时细胞损伤的进一步发生（Fernanda等，2016）。细胞发生玻璃化转变时的温度称为玻璃化转变温度，只有温度低于玻璃化转变温度才会发生玻璃化转变，水含量越低，玻璃化转变温度越低，在干燥时，由于水分的丧失，即使使用流化床工艺对物料进行干燥，细胞质也很难发生玻璃化转变，但在干燥后的低温储存过程中，细胞质会发生玻璃化转变（Khalloufi等，2010）。

2.3冷冻损伤 真空冷冻干燥是保存乳酸菌最方便最成功的方法，然而，真空冷冻干燥不可避免地对乳酸菌造成损伤，导致活性降低甚至死亡。

在冷冻干燥前，一般会对乳酸菌进行预冷冻，在超低温下细胞内大量水分快速形成冰晶，对细胞膜、细胞器、核膜等造成机械损伤，冰晶的大小跟预冻温度有关，预冻温度低，冻结速率快，细胞内水分还未渗透出细胞，形成的冰晶大；相反，预冻温度高，形成的冰晶小；冰晶越大，对细胞的损伤越大（牛春华等，2019）。王飚等（2009）在冷冻干燥德氏乳杆菌时发现细胞膜的通透性显著增加，细胞的活性大大降低。Castro等（1996）发现在冷冻干燥保加利亚乳杆菌前后，细胞内外的K+和Na+的比例发生了很大的改变，表明细胞膜的通透性发生改变。此外，在低温下，细胞膜上的饱和脂肪酸含量会升高，不饱和脂肪酸含量会降低，细胞膜的流动性降低，导致细胞代谢异常（吴文茹等，2017）。

真空冷冻干燥还会造成乳酸菌DNA构象的改变，Hlaing等（2017）报道称鼠李糖乳杆菌GG在真空冷冻干燥过程中，其DNA由B型构象转变为A型构象，相较于B型构象，A型构象的结构更紧密，不利于转录因子和RNA聚合酶的结合，从而影响基因的表达。Santivarangkna等（2010b）利用傅利叶-红外光谱技术（FT-IR）观察细胞的FT-IR图谱猜想，冷冻干燥瑞士乳杆菌细胞生理损伤的原因可能是DNA/RNA的改变。

此外，由于细胞内外液组成的不同，电解质浓度不同，在冷冻过程中，细胞内外液结冰不同步，一般是凝固点稍高的细胞外液先结冰，造成细胞外液溶质浓度升高，渗透压高于细胞内液渗透压，为维持渗透压平衡，细胞内液中水分或者溢出到细胞外，降低细胞外液浓度，或者在胞内结冰，提高细胞内液浓度，这种细胞内外液溶质浓度都升高的效应被称为溶质效应（李宝磊，2011）。这种效应通常会导致两种损伤：（1）胞内水分大量溢出，造成脱水，导致细胞膜渗透性大幅增加，丧失物质屏障功能，胞内外溶质相互渗透，细胞代谢紊乱，细胞死亡；（2）胞内的高电解质环境导致功能性蛋白高级结构的破坏，丧失生理功能，导致细胞损伤（Waghmare等，2021）。

3 乳酸菌在水产养殖上的应用

随着人们对水产品需求的增大，在资源有限的条件下，促生长类抗生素的使用在一定程度上强化了水产品的产量和效益，但药品残留却易导致环境退化、抗性致病菌株的产生、抗生素在生物体内积累等问题，为解决这类问题，乳酸菌制剂以其独特的优越性逐渐成为促生长类抗生素替代品之一（Zhang等，2015）。研究表明，乳酸菌制剂在水产养殖中有着很好的效果。

3.1促进水产动物的生长 乳酸菌能改善水产动物的生长性能，降低饵料系数，提高水产品产量。Giri等（2013）在高露斯塔野鲮基础饲料中添加1.0×1010CFU/g的植物乳杆菌VSG3并饲喂60 d后，试验组的鱼体增重为125.66 g，显著高于不添加植物乳杆菌VSG3的对照组120 g；试验组特定生长率为1.88%，与对照组的1.83%之间具有显著性差异，试验组饵料系数为1.57显著低于对照组1.71。Wang等（2008）向尼罗罗非鱼养殖缸中添加1.0×107CFU/mL的屎肠球菌ZJ4，考察菌株ZJ4对尼罗罗非鱼生长性能的影响，结果表明，与不添加屎肠球菌ZJ4的对照组相比，试验组尼罗罗非鱼日增重显著升高。Wang和Gu（2010）给凡纳滨对虾饲喂含有1.0×107CFU/mL嗜酸乳杆菌RS058的饲料，养殖35 d后，试验组日增重较对照组显著提升。郑玉等（2017）在凡纳滨对虾饲料中拌喂植物乳杆菌，发现试验组的存活率和特定生长率显著增加，饵料系数显著降低。

3.2调节水产动物肠道菌群 正常动物肠道中栖居着大量的微生物菌群，受遗传、饮食和自然条件等多种因素的影响，它们不仅与宿主之间保持着一种动态平衡关系，菌群与菌群间也存在一定比例的联系，即动物肠道的微生态平衡（Shen等，2006）。肠道菌群与生物体的健康有着密切的关系，并且对宿主的营养吸收、免疫应答和肠黏膜的形态都有影响（Sha等，2016）。研究表明，水产动物肠道中主要微生物类群为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门 （Gao等，2014；Roeselers等，2011）。Gao等（2014）发现变形菌门细菌是养殖池塘刺参肠道内第一优势菌群。Huang等（2016）发现凡纳滨对虾肠道内的优势菌门以变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门为主。

乳酸菌能通过竞争营养、分泌代谢产物、竞争定植位点等方式调节水产动物的肠道菌群（崔艳红等，2018）。Sha等（2016）发现戊糖乳杆菌及其上清液能显著提高凡纳滨对虾肠道内放线菌的丰度。夏雨等（2020）通过LEfSe分析发现，植物乳杆菌YRL45能提高赤杆菌属的丰度，降低凡纳滨对虾肠道内的致病菌发光杆菌属的丰度，减少其对肠道菌群的影响。Sun等（2012）使用含有1.0×108CFU/g屎肠球菌的饲料饲喂斑马鱼60 d后发现，斑马鱼中后肠的物种丰富度和Shannon指数均显著高于对照组，变性梯度凝胶电泳条带与序列分析比对表明，屎肠球菌特异性增加了斑马鱼肠道中变形菌门、放线菌门和潜在益生菌物种。Zhang等（2014）在黑鲷饲料中添加乳酸菌发现，其肠道微生物菌群的DGGE图谱的条带数显著增加。

3.3抑制致病菌 水产动物生活的水体环境存在许多致病菌，如球菌、弧菌、沙门氏菌、嗜水气单胞菌等，致病情况取决于水体中病原菌的浓度及机体免疫力的高低。乳酸菌主要通过两种途径抑制病原菌，一种是乳酸菌可产生乳酸、过氧化氢、细菌素等多种代谢产物，乳酸与过氧化氢使肠道pH维持在较低水平，迫使大部分常见病原菌无适宜的生长环境，细菌素对葡萄球菌、梭状芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌具有拮抗作用；另一种抑菌途径是乳酸菌在肠道内的定植可竞争病原菌的营养物质和定植位点（曲木等，2021）。

Feng等（2019）从鲤鱼肠道内分离出多株乳酸乳球菌，体外条件下发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、尤其是嗜水气单胞菌具有较强的抑制作用（抑菌圈>17 mm），能降低嗜水气单胞菌对鲤鱼肠液黏蛋白的黏附作用。刘长军（2018）发现植物乳杆菌能通过增强罗非鱼的中肠黏多糖的分泌量和提高NFkB、TNF-α和IL-10细胞因子的表达来增强抗病力，降低嗜水气单胞菌攻毒后的死亡率。Dash等（2015）的研究结果表明，植物乳杆菌能提高罗氏沼虾免疫能力，有效促进罗氏沼虾生长，提高对弧菌的抗病力，这与Kongnum等（2012）在饲料中拌喂植物乳杆菌提高凡纳滨对虾对弧菌抵抗力的结论一致。

3.4调节水产动物的免疫力 目前，乳酸菌调节宿主免疫机能的机理尚不明确，可能是通过菌体表面的大分子糖类和蛋白质等活性物质或是代谢产生的活性物质来调节宿主的免疫活性（曲木等，2021）。目前的研究表明，乳酸菌能通过提高水产动物的非特异性免疫来增强水产动物的整体抗病力。Wang等（2008）在尼罗罗非鱼的养殖缸中添加屎肠球菌ZJ4，罗非鱼的髓过氧化物酶活性和吞噬细胞呼吸爆发活动显著提高，髓过氧化物酶利用氧化自由基产生次氯酸，具有杀死病原体的能力，吞噬细胞在呼吸爆发期间，能产生超氧阴离子及其活性衍生物，这些衍生物具有强大的杀菌活性，从而增强罗非鱼的免疫力。Yang等（2019）使用含屎肠球菌Y17的饲料饲喂拟穴青蟹6周后，拟穴青蟹血清超氧化物歧化酶活性显著高于对照组。郑玉等（2017）分别将融合乳杆菌和植物乳杆菌以拌料方式投喂凡纳滨对虾饲养8周后，凡纳滨对虾血清碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性较对照组均显著升高。Dash等（2014）使用植物乳杆菌作为饲料添加剂饲喂罗氏沼虾90 d后，罗氏沼虾酚氧化酶活性显著高于对照组，试验组的嗜水气单胞菌清除率为48%~72%，对照组为38%。Tarkhania等（2020）对里海拟鲤投喂含1.0×107CFU/g屎肠球菌的饲料，8周后，里海拟鲤血清溶菌酶和碱性磷酸酶活性较对照组显著增加。以上结果表明乳酸菌通过增强参与非特异性免疫相关的酶活性来提高水产动物的免疫力，从而防止细菌病毒的侵染。

4 展望

饲用乳酸菌制剂在水产养殖上的应用，不仅能解决大规模集约化养殖带来的水产动物病害防控难题，同时也能解决以往化学药物和抗生素过量使用对生态环境的破坏，逐渐成为抗生素的优良替代品之一。然而，乳酸菌的低抗逆性限制了饲用乳酸菌制剂在实际生产中的应用，制备出高活性高抗逆性的饲用乳酸菌制剂是近年来研究者面临的挑战。与真空冷冻干燥和喷雾干燥相比，处理条件温和的流化床干燥不仅节约了成本，还降低了高温对乳酸菌的损伤，对于提升饲用乳酸菌制剂的抗逆性具有很大的应用潜力，因此研究乳酸菌的流化床干燥保护剂、制粒包衣工艺、干燥时的损伤机制对制备出高活性高抗逆性的乳酸菌制剂并应用于水产养殖业具有实际意义。