Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬在急性肺损伤中的作用研究进展

陈 兴,李红卫,赵永健,冯世海

(南开大学附属医院 天津市第四医院烧伤科,天津 300222)

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征，它是严重创(烧)伤、休克、感染及外科大手术患者常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)，是临床危重患者最主要死亡原因之一[1]。在脓毒症导致的MODS中，以脓毒症急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发病率和死亡率最高，是现代创(烧)伤外科及危重病医学面临的突出难题[2]。研究表明机体过度炎症反应导致的肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)功能紊乱与脓毒性休克和 MODS 的发生发展密切相关[3]。近年来研究发现线粒体凋亡通路是引发AT-Ⅱ凋亡的重要途径，在AT-Ⅱ凋亡中起关键作用，不同凋亡途径都通过作用于线粒体来决定凋亡是否发生[4]。线粒体是双膜结构的细胞器，主要通过氧化磷酸化合成 ATP，为细胞的持续运行提供能量，与此同时,也可生成活性氧簇(ROS)[5]。ROS可引起线粒体的损伤,释放促凋亡因子,以及开放线粒体通透性转换孔等导致细胞的死亡[6]。因此，在急性肺损伤过程中清除肺泡Ⅱ型上皮细胞中的受损线粒体具有重要意义。

Christian de Duve 在1980年提出“自噬(autophagy)”的概念，是细胞蛋白质和细胞器通过自身溶酶体将其降解的一个过程[7]。具体过程为由内质网及高尔基体形成的双层脂质膜，将细胞内的物质(如蛋白质聚集体，多种细胞器)进行扩展、吞噬，并包裹在自噬体之中，该自噬体往往是双层膜结构；之后，通过与溶酶体相互融合继而成熟，自噬体中包裹的内容物再利用溶酶体酶降解，最后降解产物被转运至细胞质，进行回收利用[8]。可见，自噬可将受损细胞进行回收，可通过清除非功能性蛋白质和细胞器来维持细胞稳定[9]。线粒体自噬这一概念首次由Lemasters等提出[10]，线粒体严重损伤或融合受损后，线粒体内碎片会逐渐增多，这些碎片、受损和衰老的线粒体随后被细胞选择性地清除，从而达到维持细胞内环境稳定的过程。在肺泡Ⅱ型上皮细胞中，线粒体自噬通过调节线粒体的质量与数量维持其正常运行，但当受到氧化应激、缺血、缺氧等刺激时，过度的线粒体自噬或线粒体自噬不足均可影响肺泡Ⅱ型上皮细胞的功能，甚至导致肺泡Ⅱ型上皮细胞死亡，因此严格控制肺泡Ⅱ型上皮细胞中线粒体自噬的激活程度将十分必要[11]。线粒体自噬仅存在于哺乳动物细胞中，是其特有的选择性自噬方式。目前对线粒体自噬调控通路的研究中，发现主要有NIX/BNIP3和FUDNC1以及PINK1/Parkin三条信号通路[12-13]。其中，目前研究最广泛的线粒体自噬途径为Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，本文就其在急性肺损伤中的作用予以综述。

1 Pink1、Parkin 的结构及其介导的线粒体自噬

1.1Pink1、Parkin的结构：Pink1蛋白作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶发挥作用，含有581种氨基酸残基，由N端线粒体靶向序列、跨膜结构域和激酶结构组成[14]。其N端为靶定信号，连接疏水跨膜区，为线粒体内膜转移终止信号，156～509之间的残基构成丝氨酸/苏氨酸跨膜结构域，连接C端结构域，作为线粒体外膜滞留信号[15]。其N端线粒体靶向序列在线粒体外膜转位酶和线粒体内膜转位酶的作用下将Pink1导入线粒体内[16]，经早老素相关菱形蛋白降解，使Pink1维持在较低表达水平[17]。通常在生理情况下，细胞内Pink1含量极低，而在细胞受到相关刺激，导致线粒体膜电位受损时，PINK1进入线粒体内膜的路径被阻断；此时，PINK1将逐渐聚集于受损的线粒体外膜，并将Parkin募集至受损线粒体[18]。

Parkin是一种E3泛素连接酶，多数位于细胞质、少数位于线粒体，由465种氨基酸组成，其N端是一个泛素样结构域和4个富含半胱氨酸并能与锌结合的RING结构域[19]。其中，泛素样结构域可以被Pink1 磷酸化激活[20]。Parkin 主要位于胞质中，既具有连接酶的活性，使底物被蛋白酶识别并降解，又可以通过单泛素化底物或由泛素内赖氨酸形成泛素化长链，从而调控信号通路[21]。

1.2Pink1/Parkin介导的线粒体自噬：经典的线粒体自噬途径为Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，它也是目前受到关注最多的线粒体自噬途径，得到的研究也最广泛。细胞在受到多种刺激条件刺激下(如：营养缺乏、细胞衰老、炎性反应、缺血、缺氧等)，细胞内线粒体的代谢方式由有氧代谢转化为无氧代谢，线粒体外膜被诱导产生去极化，致使线粒体内外膜转位酶和水解酶功能均发生障碍，阻断Pink1的转位与降解，使得Pink1聚集在线粒体上[22]; 然后，位于Parkin的丝氨酸65残基和泛素被Pink1磷酸化，从而激活Parkin[23]; 同时，Pink1 在苏氨酸11和丝氨酸42处对线粒体外膜融合蛋白2磷酸化，从而招募Parkin聚集[14]; 最后，聚集在线粒体外膜的Parkin 将外膜蛋白泛素化，进而与微管相关蛋白相结合，并逐渐将受损或碎片化的线粒体包裹进自噬体中，进一步与溶酶体相融合，从而降解与清除这些受损线粒体[24]。Pink1和 Parkin的缺失会使细胞对受损线粒体的降解能力降低，使得受损细胞器累积，最终导致细胞死亡[25]。因此，Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬对于维持细胞内环境的稳定和细胞生存具有重要意义。

2 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬的调控

2.1Pink1的磷酸化与Parkin的泛素化调控：线粒体外膜去极化后，聚集在其表面的Pink1可以通过磷酸化泛素来激活和招募Parkin，而含EF-hand结构域2的蛋白磷酸酶可拮抗Pink1的磷酸酶，抑制Pink1依赖的线粒体自噬[26]。蛋白磷酸酶PTEN-L也可抑制泛素磷酸化，阻断磷酸化泛素链的形成;此外，PTEN-L还可防止Parkin向线粒体的移位，抑制Parkin的E3泛素连接酶活性，并阻止其诱导的线粒体自噬[27]。由此可见，Pink1的磷酸化在Pink1/Parkin介导的线粒体自噬中具有重要的调控作用。在Parkin泛素化在Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的调节作用中，泛素特异性蛋白酶30起到对抗Parkin介导的泛素化的作用，从而抑制线粒体自噬的发生[28]。而泛素特异性蛋白酶33可以从Parkin中去除泛素耦联物，在Lys435处使Parkin去泛素化，抑制Parkin蛋白转移至去极化的线粒体上，从而抑制线粒体自噬的发生[29]。因此，Pink1的磷酸化功能与Parkin泛素化功能的调控可以影响其介导的线粒体自噬的激活，达到控制线粒体质量和数量平衡的目的。

2.2氧化应激对 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬的调控：活性氧类(ROS)是线粒体在呼吸作用中产生恶副产物。ROS可以启动一系列氧化损伤反应，破坏线粒体膜蛋白，使线粒体 DNA 发生突变，翻译异常，进而使得异常蛋白质增加，并发生错误折叠与聚集；同时，ROS还可致使线粒体通透性发生转变，引起线粒体肿胀、功能失调等一系列改变，最终导致细胞凋亡增加[30]。Eliza Tsitoura对比了原发性肺纤维化(IPF)患者与健康个体肺泡灌洗液中线粒体活性氧(mtROS)、线粒体形态、相关基因表达和线粒体自噬相关因子PINK1、PARK2和NRF1水平。结果提示IPF患者肺泡巨噬细胞中的线粒体存在明显的形态学缺陷和转录受损，与线粒体稳态调节因子PINK1、PARK2和NRF1的显著减少平行。同时，mtROS在IPF中显著升高，提示在IPF患者中ROS可激活线粒体自噬的过程[31]。

研究显示，ROS 是线粒体自噬的必要条件[32]。羰基氰化物间氯苯腙可促进ROS的产生，诱导线粒体去极化，将过氧化物酶6招募到去极化的线粒体上，促进Parkin从细胞质通过线粒体外膜转移到线粒体中，最后通过自噬途径将受损线粒体清除[33]。另有研究显示，邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯和1，4-苯醌均可通过增加 ROS 的产生，降低线粒体膜电位，增强线粒体碎片化，加剧了线粒体损伤，同时，增加磷酸化泛素(pSer 65 Ub)水平，并导致Parkin在线粒体激活、易位，进而激活线粒体自噬通路[34]。

氧化应激及其主要产物ROS是 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬发生的重要调控因素，因此可以通过调节氧化应激水平来对 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬进行调控。

2.3血红素加氧酶-1(HO-1)对 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬的调控：HO-1可调节血红素分解代谢过程，是其限速酶之一，细胞通过在线粒体募集HO-1，可启动线粒体自噬过程，参与线粒体的调节[35]。通过给予不同浓度LPS以建立脓毒症ALI模型，发现随着LPS浓度升高，肺上皮细胞中胞p-RIP3、RIPK1、p-MLKL、TNF-α、PINK1、Drp1、LC3B蛋白相对表达水平均升高,线粒体膜电位降低，提示LPS可导致肺上皮细胞坏死性凋亡，并激活线粒体自噬。同时，HO-1诱导并激活线粒体自噬的动态过程，使得Mfn2、OPA1、Drp1增加，并在mRNA和蛋白质水平促进了线粒体自噬的关键介质(Parkin、PINK1)的生成[36]。

3 Pink1/Parkin 介导的线粒体自噬在急性肺损伤中的作用

在体内实验和体外实验中，应用脂多糖(LPS)均可诱导产生急性肺损伤ALI，而线粒体自噬在ALI的不同阶段可以发挥着不同的作用。在早期阶段，细胞死亡主要由自噬引起，这种情况在伤后2 h达到峰值;随着ALI进展,肺组织细胞中自噬逐渐下调而调亡逐渐上调[37]。骨髓间充质干细胞(MSC)通过PINK1/parkin信号通路增强自噬，导致线粒体裂变蛋白DRP1和其他DAMP途径介质(如S100A4和S100A8、HMGB1、RAGE和AGE)显著增加，受损的线粒体及线粒体碎片得到清除，同时mfn1、mfn2和opa1等融合基因的表达得到增加，最终减少了ALI时肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤，起到保护肺泡上皮细胞的作用[38]。线粒体自噬在氯气诱发的ALI反应过程中发挥了保护性作用,将NCI-H441(人肺腺癌上皮)细胞暴露于氯气中，作用1 h后，细胞生物能功能和线粒体膜电位下降。用线粒体氧化还原调节剂MitoQ治疗可减轻这些生物能缺陷；暴露后6 h，自噬显著增加。NCI-H441细胞用自噬激活剂海藻糖预处理后，再暴露于氯气作用，其细胞的功能得到改善，而使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤进行预处理，可导致细胞功能障碍增加，表明线粒体自噬在体外可发挥保护作用[39]。

而在机械通气中，线粒体自噬对肺部功能的作用则截然相反。大潮气量通气可以快速激活肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬，选择性沉默肺泡Ⅱ型上皮细胞Atg5基因,可以增加机械通气诱发的NLRP3炎症小体活化及肺损伤。由此可见，抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体自噬活化,会加重机械通气相关ALI[40]。与此相反，在高氧诱导的急性肺损伤中，大鼠的肺miR-21-5p水平显著降低，miR-21-5p通过与靶基因PGAM5直接结合，抑制线粒体自噬和线粒体功能障碍，反而可以改善高氧诱导的急性肺损伤。而过度激活的线粒体自噬，则加重肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤[41]。

4 小结

ALI是临床常见的急危重症，机体通过产生ROS 和减少ATP 释放引起线粒体功能障碍，加重病情进展。作为一种保护性诱导过程，在肺泡Ⅱ型上皮细胞中适度激活线粒体自噬，可通过抑制炎性反应，有效保护肺功能，为ALI的治疗提供新的思路。但目前关于Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的研究主要集中在针对肺巨噬细胞，对肺泡Ⅱ型上皮细胞的研究较少，且Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在急性肺损伤中的作用存在也不同的观点。线粒体自噬是一个动态过程，在单一静态时间点评估Pink1/Parkin的表达可能会产生误导性结果，调控其适度激活具有一定难度，且因此未来需对线粒体自噬进行全面评估，以把控急性肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体自噬的激活程度，从而对急性肺损伤的治疗提供指导。