花椒抑制神经性疼痛的作用机制探讨

赵 忠 叶河杨 申小年

（安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241000）

0 引言

神经性病理性疼痛（Neuropathic Pain，NP）是一种常见的由体感神经系统损伤或疾病引起的慢性顽固性疼痛，导致患者出现睡眠障碍甚至抑郁，严重影响患者的生活质量[1]。最近基于聚类分析研究表明，大多数神经性疼痛患者可分为三种感觉表型之一：感觉丧失、机械痛觉过敏和热痛觉过敏[2]。伤害性疼痛涉及在不损害神经系统的情况下激活伤害感受器，而神经性疼痛与中枢或外周神经系统的改变有关。慢性疼痛本身以及从急性疼痛到慢性疼痛的转变可能是由表观遗传控制的[3]。感觉表型与神经性疼痛状况对幸福感、日常功能和生活质量的影响有关，但与疼痛强度的相关性较小。NP 即直接由影响体感系统的病变或疾病引起的疼痛，是一种常见的临床问题，通常表现为持续疼痛（灼烧、挤压）或阵发性疼痛（电击样感觉、刺痛）、诱发（触诱发、压力诱发、冷诱发）或麻木和感觉异常[4]。

花椒因其独特的香气和味道而在中国是一种非常珍贵的香料[5]。不同的成分引起的芳香感觉是不同的，这归因于与瞬时受体电位通道蛋白V1(TRPV1)、瞬时受体电位通道蛋白A1(TRPA1)的相互作用机制不同[6]。花椒所含的生物碱类成分主要有茵芋碱（Skimmianine）、青椒碱（Schinifoline）、香草木宁和帕洛平等。羟基α 山椒素（Hydroxy-α-sanshool，HAS）是不饱和脂肪酸酰胺从花椒中提取出来，具有降血脂、降血糖、抗炎、神经营养等作用[7]。HAS 通过降低AD 小鼠海马Cyt-c、Bax 和Caspase 3 的mRNA 和蛋白表达，增加Bcl-2 的表达，显著抑制神经元凋亡。因而花椒及其所含生物成分，在NP 疾病的治疗中有潜力，但其作用机理仍然不清楚。基于网络药理学的方法，本研究的重点是调控效应的机理，阐明花椒在分子水平上对神经性疼痛特异性靶点和分子信号通路的作用，并设计新的药物开发及临床应用。

1 材料和方法

1.1 药物和疾病相关效应的目标获取

利用数据库TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索了花椒的化学成分信息。在UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/uniprot/）中获得人类基因靶点。

为了获得NP 相关的靶基因，将搜索词“神经病理性疼痛”输入GeneCard（http: // www.genecards.org）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://www.omim.org）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org）和TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库。数据库搜索结果被合并，删除重复的目标器以获取所有的目标的靶点。

1.2 获取药物靶点基因和疾病基因交集图

利用Venn2.1 软件，将筛选出的花椒的活性成分对应的靶点与NP 靶点对应的疾病靶点进行交叉，并通过Venn 图获得共同的靶点。将预测目标导入String 数据库（https://string-db.org/）以进行进一步的预测。

1.3 药物活性成分的构建与疾病

使用Cytoscape3.8.0 软件生成了活性组件与目标之间的相互作用以及靶标之间的相互作用的网络图。用网络将药物名称、药物活性成分、药物与疾病交叉基因靶点及其之间的关系网络导入Cytoscape 软件，构建“药物—化合物—靶点”网络图进行可视化分析。

1.4 核心基因筛选

PPI（Protein-Protein Interaction）是指两个或两个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体（Protein complex）的过程。STRING 数据库收集了一个大量的蛋白质相互作用，并含有一个数据置信范围低置信值：＜0.4；最低置信度：0.15；中度置信度：0.4；高置信：0.7；最高置信度：0.9。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

各种生物信息分析和可视化结果可以通过软件R 项目来实现。首先，获得核心靶点的Entrez 基因ID 通过RGUI 和组织。然后是GO 函数富集（分子功能，MF；生物过程，BP；细胞组分，CC）和KEGG 通路丰富的RGUI，剂量和集群分析器。再设置pvalue ≤0.05，分析的结果是选择了前8 个条目的富集和以条形图的形式显示。

2 结果

2.1 获取药物靶点基因和疾病基因交集图

从数据库中共鉴定出101 个化合物相关靶点（注：OB≥0）和药用类（DL≥0）。共获得1 593 个神经病理性疼痛靶基因和花椒336 个成分靶点的112 疾病相关基因。图1、图2 所示。

图1 神经病理性疼痛疾病基因交集Venn 图

图2 花椒成分靶点与神经性疼痛疾病基因交集的Venn 图

2.2 花椒活性成分基因靶点网络的构建

为了明确中药、活性成分和花椒的潜在靶点之间的关系，用网络将药物名称、药物活性成分、药物与疾病交叉基因靶点及其之间的关系网络导入Cytoscape3.8.0 软件，构建“药物化合物—靶点”网络图进行可视化分析，如图3 所示。

图3 花椒药物分子与神经性疼痛疾病基因相关性交接图

2.3 PPI 蛋白质互作网络和核心蛋白网络

通过蛋白互作网，发现NP 的主要靶点为SRC、HSP90AA1、JUN、MAPK3、RELA、AKT1 和ESR1。GO项目数为2009 项（P＜0.05），其中BP∶1 745 项，CC∶87 项，MF∶177 项。MF 与转录因子以及一种特异性蛋白相互作用，并表现出良好的抗氧化活性，如图4 所示。

图4 蛋白质间的相互作用网络；潜在治疗靶点的核心基因

2.4 GO 和KEGG 富集

为了通过调节特定途径来研究药物治疗中靶点的生物学效应。根据富集程度筛选前30 绘制柱状图。同样，选择（P＜0.05）为聚类分析的重要路径，根据富集程度筛选前30 绘制柱状图和气泡图。

GO 分析显示，发现了大部分潜在的靶点在BP，其中包括：药物反应、循环系统中的血管突起、调节管径调节血管直径、管径调节、对脂多糖、对细菌来源分子的反应、血管直径负调节、多细胞有机过程、血管缩小。图5 是GO 富集分析的前30 十个主要影响通路。

KEGG 富集分析显示，影响了171 条通路（P＜0.05）。对神经病理性疼痛作用显著的有5 个富集通路，包括：IL-17 信号通路、MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路、ErbB（表皮生长因子受体）信号通路、cGMP-PKG 信号通路、含血清素的神经突触。

IL-17 信号通路： 上调 Casp、NF-κB、AP-1、Hsp90、IKKα、IKKβ、IκBα、MAPKs、ERK、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL10、CCL2、COX2、MMP1、MMP3、MMP9、IL-1β、IFN-γ；

MAPK 信号通路：上调GF、RTK、PKA、PKC、NFκB、Rafl、EKR、E1K-1、c-fos、AP1、CASP、AKT、AP1、HSP27；

ErbB 信号通路：上调PKC、Src、ErbB-3、Jun、Raf、ERK、Elk、PKB/Akt、GSK-3、E1K、PKB/AKt、GSK-3；

cGMP-PKG 信号通路：上调GPCR、βAR、Akt、RhoA、Raf-1、ERK；

含血清素的神经突触：上调SEART、MAO-A、SERT、PKC、ERK、Cox、PKA、PKC、Casp3、ERK、Raf。

3 讨论

病理性疼痛包括炎症性疼痛和神经病理性疼痛，这是神经元可塑性变化的表现过程。主要关注疼痛管理药物在临床应用中的有效性和安全性[8]。由于躯体感觉神经系统的损伤或疾病，NP 发展成如此复杂的疾病，其发病的全部机制尚不清楚。神经免疫系统的激活有助于神经损伤后神经性疼痛的诱导和持续存在。TNF-α/IL-1β介导的NF-κB 活性的激活释放了多种炎症介质，这可能会导致疼痛加重[9]。外周性和中枢敏感性是疼痛产生的病理基础，其中细胞内信号通路的激活在其潜在机制中起着关键作用。外周伤害性感受信号通过传入神经纤维导入脊髓背角，导致兴奋性氨基酸和应激蛋白的上调。它导致伤害性神经元持续去极化，并有大量的钙离子流入。一般来说，MAPK 信号通路涉及多种改变和改变的细胞信号转导通路。MAPK 是真核细胞中的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它不仅参与炎症和细胞凋亡，而且在介导神经可塑性和神经功能方面也至关重要。这是一个促进周围神经和中枢神经痛觉过敏形成的过程，这有助于疼痛感觉[10]。MAPK 级联包括ERK、JNK/SAPK、p38MAPK 和ERK5。这种平行信号通路与疼痛的形成、维持和增强显著相关。p38MAPK 与炎症密切相关，是中枢胶质细胞中产生促炎因子的重要途径，也是干预疼痛的关键靶点。

4 结语

花椒是一种常见的中草药，具有化学复杂性和生物功能多样性的特点，笔者采用网络药理学的生物信息学方法来阐明其生物活性成分发挥镇痛作用，并探讨其潜在机制。本研究结果表明，花椒更适合于血管痉挛、炎症因子和神经交互影响等因素引起的疼痛。花椒的生物活性化学物质及其潜在靶点作为其镇痛作用的潜在机制，有利于临床药物的开发和潜在机制的阐明。