先天性非溶血性黄疸的临床病理与中医证候特征

刘香丽，马素平，王欣欣，张丽慧，王娇，杨晓青

(1.河南中医药大学第一附属医院 a.病理科；b.脾胃肝胆科；c.儿科医院实验室，河南 郑州 450000；2.北京佑安医院 病理科，北京 100167)

先天性非溶血性黄疸是指肝内胆红素、胆汁代谢相关基因改变导致代谢酶功能障碍，最终导致血清胆红素升高的一组疾病，临床表现为巩膜、皮肤、黏膜等发生黄染，该类疾病临床分为以间接胆红素(indirect bilirubin，IBIL)升高为主型和直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)升高为主型[1]。先天性非溶血性黄疸由于临床表现多样且不典型致使临床诊断有一定困难，而超声引导经皮肝穿刺活检抽取少量肝组织进行组织病理学检查仍是诊断和辨别其类型的有效手段，该方法具有损伤小、操作简便等特点[2]。本文就河南中医药大学第一附属医院脾胃肝胆科和北京佑安医院近6 a来收治的32例先天性非溶血性黄疸患者进行回顾性分析，初步统计其常见分型的占比，总结先天性非溶血性黄疸患者的主要病理特点、临床特征及中医证候，为先天性非溶血性黄疸患者的诊治提供帮助。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2014年4月至2019年10月河南中医药大学第一附属医院以“黄疸待查”为诊断的29例患者和北京佑安医院收治的3例Crigler-Najjar综合征Ⅱ型(Crigler-Najjar syndrome Ⅱ，CNS-Ⅱ)患者。患者年龄 8～58岁，平均(36.16±14.14)岁，其中男11～58岁，女8～48岁。本研究经医院医学伦理委员会批准，取得患者同意。

1.1.1纳入标准 (1)实验室检查血清总胆红素高于34 μmol·L-1，IBIL高于17.1 μmol·L-1或DBIL高于23.7 μmol·L-1；(2)转氨酶正常；(3)身、目黄染；(4)红细胞脆性正常。

1.1.2排除标准 (1)病毒性/药物性肝炎患者；(2)自身免疫性肝病患者；(3)合并其他系统严重疾病患者，如恶性肿瘤；(4)胆道梗阻性患者；(5)慢性溶血性贫血患者。

1.1.3分组标准 依据胆红素的性质进行分组，IBIL高于17.1 μmol·L-1为IBIL升高组，DBIL高于23.7 μmol·L-1为DBIL升高组。

1.1.4中医证候标准 参照中国中医药出版社全国高等中医药院校规划教材(第2版)《中医内科学》[3]，主要症状为目黄、身黄、小便黄，尤目黄为要，可兼有发热，胃脘腹痞闷，头身困重，大便稀溏等表现，危重情况可有肌肤瘀斑、手足抽搐、神昏谵语等重症表现。

1.2 方法

1.2.1实验室检测 患者于入院翌晨空腹抽取静脉血送检，检测指标为：谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(alkaline phospha-tase，ALP)、谷氨酰转肽酶(gamma glutamyltransferase，GGT)、DBIL、IBIL。

1.2.2肝穿刺活检术及病理染色 肝脏超声引导下穿刺肝组织1～2条，长度1～2 cm，体积分数为4%的甲醛水溶液固定后石蜡包埋，3 μm切片进行常规苏木精-伊红(HE)染色及特殊染色D-PAS、普鲁士蓝染色。

1.2.3外周静脉血基因检测 提取3例患者外周静脉血基因组DNA，其中2例CNS患者采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因、1例进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(progressive familial intrahepatic cholestasis type 2，PFIC2)患者采用PCR方法扩增ABCB11基因。

1.2.4统计学处理 采用IBM SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料以中位数和四分位数[M(P25，P75)]表示，两样本间比较采用独立样本非参数检验(Wilcoxon检验)；计数资料以率或构成比(%)表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 先天性非溶血性黄疸的构成比本研究纳入的32例患者中IBIL升高组27例(84.38%)，包括Gilbert综合征(Gilber syndrome，GS)20例(62.5%)和CNS-Ⅱ 7例(21.88%)；DBIL升高组5例(15.62%)，包括Dubin-Johnson综合征3例(9.38%)、Rotor综合征1例(3.12%)、PFIC2患者1例(3.12%)。

2.2 先天性非溶血性黄疸的性别比较GS、Dubin-Johnson综合征、CNS主要以男性为主，两组性别比较差异无统计学意义(P=0.637)(图1)。

图1 不同先天性非溶血性黄疸的性别比例

2.3 症状、体征及中医证型根据两组患者入院时及住院期间的症状及体征统计所得：身、目、尿黄(32例，100%)、间断右胁不适(11例，34.38%)是先天性黄疸患者最常见的临床表现，少数患者乏力(2例，6.25%)、脾大(3例，9.38%)、皮肤瘙痒(2例，6.25%)、发育迟缓(1例，3.12%)、上腹痛(1例，3.12%)。

中医证型，IBIL升高组和DBIL升高组阴黄占比多于阳黄，阳黄组中的各证型在IBIL升高组和DBIL升高组之间差异无统计学意义(P=0.341)，阴黄组中的各证型在IBIL升高组和DBIL升高组之间差异无统计学意义(P=0.612)(表1)。

表1 两组患者中医证候[n(%)]

2.4 肝功能IBIL升高组和DBIL升高组中 ALT、AST、ALP、GGT数值在正常范围内，且二者比较差异无统计学意义(P分别为0.336、0.792、0.676、0.583)；IBIL升高组中，CNS-Ⅱ患者IBIL(P<0.001)和DBIL(P=0.003)的升高程度都高于GS患者，见表2；DBIL升高组中，Dubin-Johnson综合征、Rotor综合征和PFIC2患者的DBIL值分别为33.1(中位数)、72.10、277.60 μmol·L-1。

表2 IBIL升高组的肝功能[M(P25，P75)]

2.5 组织学表现IBIL升高组中GS(图2A)和DBIL升高组中Rotor综合征肝小叶结构大致正常，无特异性组织学表现(图2E、F)。DBIL升高组中Dubin-Johnson综合征主要表现为肝中央静脉和毛细胆管周围肝细胞质内见较多棕黑色色素颗粒沉积(图2B)；PFIC2主要表现为小叶内肝多核巨细胞的形成，形状似假腺泡样(图2G、H)。具体组织学改变见图2、表3。

A为GS，肝小叶大致正常，中央静脉周围肝细胞质内脂褐素颗粒沉着(HE，400×)；B为Dubin-Johnson综合征，中央静脉周围肝细胞毛细胆管侧有大小不等的棕黑色颗粒(HE，252×)；C、D为CNS-Ⅱ型，左图为汇管区纤维性扩大，与邻近汇管区相连形成桥接纤维隔，少量混合性炎细胞浸润(HE，252×)，右图为汇管区纤维化，汇管区周围肝细胞内铁颗粒沉积(普鲁士蓝染色，252×)；E、F为Rotor综合征，左图为肝小叶大致正常(HE，252×)，右图为汇管区未见明显炎细胞浸润(HE，252×)；G、H为PFIC2，左图为汇管区轻度混合性炎细胞浸润，纤维组织轻度增生，小叶间胆管可见(D-PAS，400×)，右图为肝细胞肿大、淡染，胞浆内见胆色素颗粒，散见毛细胆管胆栓，Kupffer细胞肿大含胆栓，少量多核巨细胞(D-PAS，400×)。

表3 不同先天性非溶血性黄疸发生各种病理学改变的构成比[n(%)]

2.6 相关基因检测分别对2例CNS-Ⅱ患者和1例PFIC2患者进行了基因检测，CNS-Ⅱ患者UGT1A1基因检测结果：1例检测到3个突变点分别为第1外显子发现1个错义突变c.211G>A、c.G211A(p.Gly71Arg)、第3外显子发现碱基缺失c.1009_1015delTACACTG(p.Tyr337Glu)、第5外显子1个错义突变c.1456 T>G、(p.Tyr486Asp)；另1例检测到UGT1A1基因第5外显子上发现1个错义突变c.1471 G>A(p.Val491Met)，为纯合子。PFIC2患者基因检测结果：ABCB11基因突变，在ABCB11基因上发现1个错义突变c.499 G>A(p.Ala167Thr)，为杂合子；在ABCB11基因上还发现1个错义突变c.172 G>A(p.Asp58Asn)，为杂合子。

3 讨论

通过回顾性分析32例先天性非溶血性黄疸患者发现Gilbert综合征所占比率最高，其次为CNS-Ⅱ和Dubin-Johnson综合征；Rotor综合征和 PFIC2所占比率最低。

本研究所涉及两组类型疾病(5种具体疾病)，这些疾病的临床症状和体征具有一定的重叠性，如身、目、尿黄和右胁不适等，随着疾病的进展会出现更严重的临床体征，如脾大、发育迟缓等[4]。

同一种疾病的不同患者会表现不同中医证型[5]，本研究发现阴黄患者所占比率较高，可能此类患者先天禀赋不足，脾阳素虚，或湿从内生，阻于肝胆，或湿从寒化，寒湿阻遏，致胆汁不循常道，随血泛溢，浸淫肌肤，发为阴黄[6]。部分患者后天或嗜食厚味，或摄生不当，致湿从热化或重感湿热，熏蒸于脾胃，累及肝胆，发为阳黄。中医证型对临床中医治疗具有指导意义[7]，中医证型与直接/间接胆红素升高之间无明确相关性，该研究样本少，有待以后深入探讨。

IBIL升高组GS和CNS-Ⅱ均属于UGT1A1基因病，UGT1A1基因启动子区和编码区氨基酸突变使UGT酶蛋白活性分别下降至正常人的30%和10%，进而导致IBIL不同程度升高，有文献显示血清总胆红素水平为85 μmol·L-1是两者的分界点[8]，也有研究规定为102.6 μmol·L-1；本研究以血清总胆红素水平超过85 μmol·L-1界定为CNS-Ⅱ，研究显示两者临床症状并无明显差别。20例GS患者多为中青年男性，病理表现偶见点灶状坏死，无汇管区纤维化，预后良好，无需特殊治疗；而7例CNS-Ⅱ患者中2例出现了纤维化，并且1例出现了桥接纤维化，CNS-Ⅱ纤维化若不及时治疗，有可能发展为肝硬化且预后不良[9]，该发现与国外研究[10-12]报道一致。文献报道，CNS-Ⅱ患者的肝活检比GS患者更易发生铁沉积[13]。

UGT1A1基因检测方面，1例CNS患者检测到2个碱基突变点c.211G>A、c.1456 T>G，1处碱基缺失c.1009_1015delTACACTG，前2个突变点是已报道中最常见的突变点[14]，且c.1456 T>G碱基突变会严重影响UGT酶蛋白活性[15]；相关文献报道UGT1A1基因检测到c.1456T >G、c.625C>T突变患者，可倾向CNS-Ⅱ型的诊断[16]。另1例CNS患者检测到第 5外显子1个错义突变c.1471 G>A(p.Val491Met)，属纯合突变，患者的父母为该突变的杂合子，该突变点在HGMD数据库未见文献报道，生物信息学软件分析认为其致病可能性较高。大多数CNS-Ⅱ患者具有纯合错义突变或复合杂合突变，可将UGT酶活性降低至正常值的10%以下[17]。目前，已报道的UGT1A1基因突变点有160多个，但每个突变点的致病程度尚未完全清楚[18]，需积累更多的临床资料[19]。在实际工作中，血清总胆红素在某些条件下会发生波动，当血清总胆红素在临界值发生波动时，GS与CNS-Ⅱ很难截然区分[7]，需结合患者的临床症状、基因突变位点、对苯巴比妥治疗的反应程度综合分析[20]。文献对于总胆红素高于100 μmol·L-1且以IBIL升高为主的患者及时行肝穿刺活检可明确纤维化程度，对临床后续治疗有指导意义[21]。

DBIL升高组中Dubin-Johnson综合征和Rotor综合征临床症状和肝功能指标均相似，二者可以通过肝穿刺病理检查进行鉴别[22]。Dubin-Johnson综合征肉眼呈黑褐色；镜下具有特征性病理表现：中央静脉和毛细胆管周围肝细胞胞质内见较多棕黑色色素颗粒(脂褐素-黑色素复合物)沉积[23]。而Rotor综合征肉眼正常；镜下表现肝小叶大致正常，无色素颗粒沉积。基因检测SLCO1B1、SLCO1B3可证实诊断[24]。PFIC2临床症状为皮肤瘙痒、发育迟缓；镜下肝细胞肿胀、淤胆明显，局灶见少量多核巨细胞，汇管区纤维化明显伴桥接纤维化形成[25]。其病理改变明显重于Dubin-Johnson综合征和Rotor综合征，纤维化的出现提示PFIC2预后不良[26]。有关文献指出，PFIC2最重要的病理特征是小叶内肝多核巨细胞的形成，形状似假腺泡样，肝多核巨细胞的数量不同病例之间会有差别[27]。最近研究报道欧洲 D482G突变型多核巨细胞的数量明显少于其他突变型[28]，另外血清GGT偏低或正常是 PFIC2重要的血清学特点[29]。

本研究对32例非溶血性黄疸进行了回顾性分析，Dubin-Johnson综合征可依据其特异的组织学表现明确诊断，但一些黄疸患者组织学表现并不特异，需结合临床资料、血清胆红素水平及基因突变位点综合诊断。另外，纤维化的出现及纤维化的程度可以指导临床治疗及提示预后。总之，肝穿刺活组织病理在临床先天性非溶血性黄疸的诊断与鉴别诊断中起着重要的作用。中医证型对临床中医治疗具有指导意义。由于Rotor综合征和PFIC2病例属于罕见病例，在本文中未能提供较多的数据支撑，在以后的工作中，有待于积累更多的临床资料揭示基因突变与组织学之间的关系，分析中医证候特点，以便更好地服务于临床。