耐受性树突状细胞抑制炎症性疾病的机制及进展①

崔博 曾瑜真 陈智鸿（复旦大学附属中山医院呼吸科，上海 200032）

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前所知的功能最强大的抗原递呈细胞，其通过递呈抗原激活T细胞，在启动和形成免疫反应中发挥至关重要的作用［1］。DCs的活化状态对其启动的免疫反应具有不同的影响。例如活化的DCs表达高水平的共刺激分子可促进炎症细胞因子产生，刺激T细胞增殖；未激活或未成熟的DC表达低水平的共刺激分子，产生调节性细胞因子，抑制T细胞增殖，起到免疫抑制作用，因而被称为耐受型DC（tolerogenic DC，tolDC）［2］。DCs对于维持免疫耐受至关重要，其通过各种机制限制效应T细胞并促进外周调节性T细胞（T regulatory cells，Tregs）分化，包括产生细胞因子（如IL-10、IL-27和TGF-β）、吲哚胺2，3双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的表达、表面共刺激分子的表达控制等。对自身抗原和周围环境抗原的免疫耐受缺陷可导致炎症和自身免疫性疾病的发展。近年来，tolDC被应用于肿瘤、自身免疫病和器官移植的基础及临床研究。现将tolDC的表型、诱导因素、产生免疫耐受的机制及临床应用综述如下。

1 参与免疫耐受的DC亚型

DCs通过其处理和递呈抗原的功能参与机体的免疫反应，其在免疫耐受方面亦发挥至关重要的作用。研究表明，参与免疫耐受的DCs大致可分为三类：常规树突状细胞（cDC）、浆细胞样细胞（pDC）和单核细胞衍生树突状细胞（moDC）［3］。cDC分为2个亚群，即cDC1亚群和cDC2亚群。cDC1特征性表达CD8α和XCR1，能够将抗原交叉呈递至CD8+T细胞，并依赖于IRF8、Batf3和Id2转录因子分化。相反，cDC2表达CD11b和CD172a，主要向CD4+T细胞呈递抗原，主要依赖IRF4分化。因此，cDC1和cDC2表现出不同的细胞表型，在小鼠中主要为CD8α+/CD103+cDC1，CD4+/CD11b+cDC2。二者依赖不同的转录因子进行分化，并执行特定的免疫功能［4］。除了T细胞的影响外，cDC还可诱导和扩增自身抗原特异性Treg，参与Treg介导的自身免疫抑制，而这种耐受的产生可能与DC亚群的未成熟状态密切相关。在这一过程中，cDC1主要诱导Treg的分化，cDC2主要诱导Treg的扩增［5］。moDC通常由炎症过程中的单核细胞分化而来，其主要表型为HLADR+CD11c+CD14intCD206+CD1c+，其 表 面 的CD1b可能是与其他DC亚群区分的标志之一；诱导单核细胞分化的细胞因子主要有GM-CSF（粒细胞集落刺激因子）、IL-4、TNF等［6］。小鼠体内实验表明，通过上述细胞因子诱导产生的moDC可有效刺激自身抗原特异性Treg增殖，维持免疫耐受［7］。pDC对于自身免疫耐受至关重要，其在体内可快速大量释放IFN-I参与免疫应答，同时既往研究表明，pDC在自身免疫性疾病如银屑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、Ⅰ型糖尿病等疾病的发病机制方面主要发挥免疫耐受作用，这一效应可能是通过调节IFN-I和CXCL4的水平实现的［8］。

2 诱导或促进tolDC形成的因素和机制

成熟DC表达高水平的Ⅱ类主要组织相容性复合物（MHCⅡ）和共刺激分子，通过诱导幼稚T细胞转化为T辅助细胞1（Th1）和/或Th17亚细胞来诱导免疫反应，而未成熟DCs含有低水平的MHCⅡ和共刺激分子，通过引导T细胞转化为Th2和Treg或导致T细胞凋亡来调控免疫应答［9］。LI等［10］研究发现，在没有炎症刺激时，DCs仍处于不成熟的状态，其细胞内含有的大量MHCⅡ阳性溶酶体对MHCⅡ起到降解作用，同时，未成熟DCs产生的外泌体可诱导免疫耐受产生，这可能和外泌体中含有较高水平的MFG-E8及低水平的MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、ICAM-1有关，表明tolDC的产生可能与DC的成熟状态有关。除了未成熟DCs外，越来越多的证据表明，成熟的DCs也可被诱导为tolDC发挥免疫调节作用。tolDC的产生可能与细胞因子有关，既往研究证明了IL-10、IL-27诱导产生的成熟DCs表现出耐受性［11］。IL-10通过抑制促炎因子IL-12的产生和DCs表面共刺激分子（如CD80、CD86）的表达从而影响后续的T细胞应答；而IL-27则促进了DCs外核苷酸酶CD39表达，CD39通过促进免疫应答环境中细胞外ATP的降解抑制了免疫应答。同时，二者都通过STAT3信号通路发挥免疫抑制功能，表明STAT3信号通路可能对DCs的功能起到负性调控作用。DCs高水平表达的芳香烃受体（AhR）在参与诱导形成tolDC过程中也发挥重要作用。AhR是一种配体激活的转录因子，饮食是其配体的主要来源，当AhR与来源于外界环境的配体结合后，能够有效诱导tolDC产生。目前已知的AhR对DCs的调节机制主要通过与NF-κB、AP-1的相互作用，抑制DCs表面MHCⅡ和共刺激分子的表达，产生耐受表型。MICHALSKI等［12］研究表明，广泛存在于水果和蔬菜中的AhR配体槲皮素能够激活DCs表面AhR，并且能够与CD83的启动子结合抑制DCs表面CD83的表达产生tolDC。同时tolDC的促炎细胞因子IL-12p70表达水平降低，免疫调节分子Dab2、ILT3、ILT4、ILT5和CD39、CD73表达增多。

3 tolDC诱导免疫耐受的细胞和分子机制

3.1tolDC的迁移DCs具有迁移能力，可到达不同的器官，根据成熟状态发挥不同功能。tolDC可能通过迁移能力的改变影响免疫应答从而引起耐受。成熟的DCs过度表达CCR7，在趋化因子CCL19和CCL21等的作用下迁移到达淋巴结，并向T细胞递呈抗原；一些DCs会迁移到其他淋巴器官，如脾脏、胸腺和骨髓［13］。在未成熟状态下，DCs表达另一些趋化因子受体，如：CCR2、CCR5、CCR6、CXCR4和CXCR3，并被表达趋化因子（如CCL2、CCL5和CCL20）的炎症组织所吸引，从而导致迁移能力的改变［14］。在MANSILLA等［15］的研究中，将VitD3诱导培养的骨髓来源tolDC静脉注射给实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠24 h后，这些细胞到达肝脏和脾脏，并持续存在7 d。在淋巴结、胸腺和骨髓中也发现少量细胞。越来越多的研究表明，DCs的迁移能力改变可能导致DCs在组织炎症部位的异常聚集和活化，促进炎症发生甚至导致自身免疫性疾病，与迁移相关的趋化因子及其受体可能是炎症性疾病的潜在治疗靶点。

3.2tolDC通过表面受体/配体介导的T细胞抑制通过DCs和T淋巴细胞间的表面分子结合和信号整合实现T细胞无能、低反应性或凋亡、抑制增殖等。例如，在未成熟DCs中表达的诱导性T细胞共刺激配体（ICOS-L）可与T细胞表达的ICOS相互作用，以诱导T细胞再刺激后的低应答［16］。另一种存在于DCs表面的免疫调节分子是PD-L1，PD-L1可与T细胞上的PD-1结合，随后抑制T细胞抗原受体（TCR）的信号转导，阻断下游效应并降低T细胞的杀伤能力［17］。Fas配体是另一种通过诱导细胞凋亡而抑制T细胞应答的接触依赖性分子［18］。DCs表面的Fas配体通过调控免疫细胞激活、分化、凋亡来实现对免疫应答的调控。

3.3免疫抑制性细胞因子与DCs的关系免疫抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β等，与DCs成熟障碍、抑制T细胞增殖及多种免疫调节功能有关。IL-10是一种抗炎细胞因子，可抑制DCs的激活和促炎细胞因子产生。IL-10通过结合酪氨酸激酶IL-10受体激活STAT3，从而抑制NF-κB移位，导致对炎症刺激的低反应性［19］。IL-10所诱导的tolDC也高分泌IL-10及HLA-G分子，从而诱导产生Ⅰ型Treg，促进和维持外周耐受。IL-27也是一种介导免疫耐受的关键细胞因子，在过敏性哮喘小鼠模型中的实验证明，预防性气管内注射IL-27可促进Treg和IL-10的产生，抑制原始CD4+T细胞分化为Th2，上调了和迁移能力相关的趋化因子CCL2、CCL3、CCL4的表达，这一效应可能与STAT1磷酸化有关［20］。TGF-β是一种与免疫抑制相关的多效性细胞因子。研究表明，TGF-β可诱导转录因子Foxp3表达从而产生Treg［21］。除了上述两种经典的免疫调节分子外，DIXON等［22］研究表明，地塞米松诱导的tolDC可分泌IL-35，IL-35是IL-12家族的细胞因子，以IL-12p35和Ebi3的异源二聚体形式存在，可诱导Treg产生一个新亚群，即iTR35细胞，从而抑制T细胞活化。

3.4酶在DC免疫耐受中的作用已有研究表明，IDO和色氨酸代谢是抑制T细胞、B细胞的必要因素［23］。IDO通过其酶活性发挥作用，催化色氨酸生成犬尿氨酸，色氨酸的消耗可激活一般性调控阻遏蛋白激酶2（GCN2）和哺乳动物雷帕霉素靶点，从而一方面导致效应细胞的抑制和无能，另一方面提高Treg活性。血红素加氧酶-1（HO-1）是一种在体内降解血红素、抑制免疫反应和炎症的细胞内酶。CHAUVEAU等［24］研究表明，未成熟DCs自发表达HO-1，而成熟的DCs则不表达。钴原卟啉处理未成熟DCs使HO-1表达上调，抑制了DCs表型成熟和促炎细胞因子的分泌，从而抑制T细胞增殖。

3.5tolDC与Treg的 相 互作用Foxp3+Treg对于维持免疫耐受和预防自身免疫病至关重要，其数量或功能的异常可能会导致自身免疫病的发生，Foxp3+Treg持续存在的必要条件是tolDC提供持续的抗原刺激。ODOBASIC等［25］的研究结果表明，NF-κB抑制剂诱导产生的tolDC通过多种途径从CD4+Foxp3-细胞中产生Foxp3+Treg，并通过诱导共刺激因子（ICOS）诱导产生IL-10+Treg。同时，也有研究表明，Foxp3+Treg可诱导产生tolDC［26-27］。Foxp3+Treg会 产 生IL-10，TGF-β从 而调 控DCs的 发育。Foxp3+Treg还可通过下调DCs表面CD80/86的表达抑制DCs成熟。总之，tolDC和Treg间可能存在着类似反馈的机制以保证免疫耐受的稳定发生。

3.6tolDC产生作用的分子机制DC的糖酵解途径也和免疫耐受息息相关，FERREIRA等［28］研究表明，在活性维生素D3（1，25［OH］2D3）诱导产生的tolDC中，与葡萄糖代谢、三羧酸循环和氧化磷酸化直接相关的几个基因表达上调。tolDC通过PI3K/Akt/mTOR通路控制糖酵解，通过激活该通路，糖酵解增强，同时DCs表面的CD80/86，HLA-DR等分子的表达减少，IL-10/IL-12p70表达增多。降低葡萄糖浓度或阻断PI3K/Akt/mTOR通路，其耐受表型均不能维持。提示免疫细胞的代谢过程可能影响表面共刺激分子的表达及细胞因子的产生从而诱导耐受。在过敏性疾病中，DCs的耐受性可能与miRNAs有关。在ZHENG等［29］的研究中，采用卵清蛋白处理使DC成熟过程受阻，其miR-23b表达水平升高，表面共刺激分子减少，IL-10产生增加，IL-12产生减少，Treg的分化能力增强。Notch信号通路在DC分化和功能调节中发挥重要作用，Notch蛋白是一类细胞发育中高度保守的跨膜蛋白，可介导T细胞激活。最近的研究表明，miR-146a可通过靶向Notch1信号促进DC的耐受性，导致其成熟过程受阻，产生耐受表型［30］。

4 tolDC的临床应用前景

DCs最初应用于诱导肿瘤特异性免疫反应的试验，由于人们认识到DCs不仅诱导而且抑制T细胞反应，因此开始将DCs应用于免疫耐受。tolDC已被用于自身免疫病的治疗，如多发性硬化、1型糖尿病、类风湿关节炎［4］。在ZUBIZARRETA等［31］关于多发性硬化和视神经脊髓炎治疗的研究中，通过利用表达特殊抗原的tolDC诱导患者产生对自身抗原例如髓鞘衍生肽、水通道蛋白4的耐受取得了一定的疗效，在治疗期间，患者外周血单核细胞产生的IL-10水平降低，Treg增多。tolDC在临床上也被用于治疗类风湿和炎症性关节炎。BELL等［32］研究表明，患者在关节镜下进行含tolDC的盐水冲洗后，5 d内未出现膝关节耀斑。在接受高剂量tolDC治疗的患者中，其症状缓解保持稳定。但能够治疗该病的具体剂量并不清楚，低剂量的治疗可能会导致疾病恶化。tolDC被认为是治疗1型糖尿病的一种有效的免疫疗法，NIKOLIC等［33］首次对负载胰岛素原肽的tolDC在临床上治疗1型糖尿病的可行性和安全性进行评估，在该Ⅰ期临床试验中，选取了9例长期1型糖尿病患者（平均病程超过12年），通过皮内注射方法将tolDC注入患者体内，在随后6个月的随访过程中，所有患者都保持了严格的血糖控制，HbA1c值稳定，β细胞功能和总体糖尿病控制保持稳定，同时没有全身免疫抑制的迹象，没有出现胰岛素过敏，并且不干扰胰岛素的治疗。但由于临床研究的局限性，这种新型免疫干预疗法仍需要进一步研究。在炎症性肠病的治疗方面，体外产生的自体tolDC能够诱导免疫耐受，具有一定的临床应用前景。在JAUREGUI-AMEZAGA等［34］对tolDC治疗克罗恩病的安全性和疗效性进行的Ⅰ期临床试验中，将体外诱导产生的单核细胞来源的tolDC在超声引导下以腹膜内注射给药的方式注入克罗恩病患者体内后，患者体内的tolDC表面共刺激分子CD80、CD86表达上调，而CD83分子则与之相反。免疫检测发现tolDC产生高水平的抗炎细胞因子IL-10，促炎因子IL-12p70和IL-23完全不存在，循环Treg的增加和IFN-γ水平的降低表明免疫抑制状态至少在细胞水平上被诱导。患者在观察随访的1年内保持无糖皮质激素临床缓解，同时也未出现任何不良反应，说明tolDC的治疗安全有效。tolDC在过敏性疾病中也有较好的应用前景，在SEMITEKOLOU等［35］的研究中，将激活素A诱导产生的Treg过继转移至气道致敏小鼠模型内，影响了IRF4基因的正常表达，导致DCs成熟受阻，摄取抗原能力减弱，增强了DCs的耐受性，改善了小鼠的哮喘表现。

5 小结

具有耐受性表型的DCs是免疫系统的重要组成部分，在健康和疾病中调节免疫应答。然而，目前尚不清楚tolDC是构成一个特定的谱系，还是仅仅反映DC的未成熟状态。事实上，这些选择并非相互排斥。可以预期的是，耐受性表型由特定的信号和转录程序控制，随着对tolDC研究的深入，了解其分化所需要的一系列条件，就能避免其使用过程中的风险［2］。目前tolDC在临床上的应用还非常有限，但就目前的研究来看，其对人体的作用大体上是安全的。对于自身免疫病和炎症性疾病来说，一旦寻找到诱导稳定tolDC的最佳方法，了解耐受产生的机制及过继免疫途径就能为该类疾病开辟全新的治疗方法。