小反刍兽疫病毒反向遗传学研究进展

2022-12-29 11:46陈延飞刘伟洁薛青红

中国兽药杂志 2022年2期

王煜，孙淼，陈延飞，刘伟洁，薛青红

(中国兽医药品监察所, 100081)

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍兽的一种急性、热性、接触性传染病，是OIE法定报告的动物传染病，我国规定为Ⅰ类动物疫病[1]。据FAO推测，全球约有62.5%的小反刍动物受到小反刍兽疫的威胁，特别是非洲、亚洲和中东地区。2007年7月我国西藏地区首次发生疫情，2013年11月新疆地区再次发生，随后疫情遍布全国大多数省份。据不完全统计，全球每年因PPR导致的经济损失高达约30亿美元，目前主要采用疫苗免疫接种对PPR进行预防，2015年OIE、FAO联合启动了《全球小反刍兽疫控制与根除策略》,提出了到2030年在全球消灭PPR的目标[2]。

1 小反刍兽疫病毒概述及复制特征

小反刍兽疫病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，同属成员还包括麻疹病毒(Measles virus， MV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)、犬瘟热病毒(Canine Distemper virus，CDV)、海豹瘟热病毒(Phocine distemper virus,PDV)、鲸麻疹病毒(Cetacean morbillivirus,CMV)、海豚麻疹病毒(Dolphin morbillivirus,DMV)[3-4]。通过基因序列比对，可将PPRV分为四个基因型，但PPRV只发现一个血清型，其中基因I、II、III型主要流行于非洲，而我国小反刍兽疫流行毒株属于基因Ⅳ型。PPRV是单股负链不分节段有囊膜的RNA病毒，绝大多数PPRV的核苷酸总数为15948 nt，RNA链从3’至5’依次分布着N-P-M-F-H-L 6个基因，共编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrixprotein，M)、融合蛋白(Fusion protein，F)、血凝素蛋白(Hemagglutinin protein，H)、大蛋白(Large protein，L)，此外PPRV P 基因有两个重叠的开放性阅读框(ORF)可编码病毒结构蛋白P和非结构蛋白C、V蛋白[5]。

PPRV复制过程中其病毒粒子中单链核糖核苷酸(ssRNA)不能直接用作转录和复制的模板，只有当基因组ssRNA与核蛋白结合形成核衣壳复合物(RNPs)以后，才能被RNA依赖的RNA聚合酶识别并作为转录的模板转录成正链RNA，以此作为mRNA翻译PPRV复制所需蛋白，与此同时，以正链RNA为模板生成负链的病毒基因组RNA。

与麻疹病毒属其它成员一样，PPRV基因组也遵循“六碱基原则”，即病毒基因组长度为6的倍数。但有研究表明，在微突变的PPRV微型基因组中插入或敲除一到两个核苷酸，PPRV也能正常复制[6]，PPRV的这一独特特征有别于其它严格遵守“六碱基原则”的麻疹病毒。

2 反向遗传学概述及研究进展

广义的反向遗传学指从生物基因组及所含生物信息出发，在获得生物基因信息的基础上，通过对基因的操作，如定点突变、插入、缺失、置换等，进行生物基因结构和功能的研究。目前，反向遗传技术已经成为推动植物学、动物学、微生物学研究发展的最前沿科学之一。

狭隘的反向遗传学是指对微生物的反向遗传操作和研究，目前已有很多病毒的反向遗传操作系统被建立起来，用以研究病毒的生命周期，了解病毒复制过程中的机制，创新了新型疫苗的研究手段，开创了病毒学研究的新局面。

由于基因组结构相对简单，反向遗传学在RNA病毒的研究中应用最为广泛，其核心是建立病毒的感染性克隆，即病毒的人工构建。了解病毒的基因组结构特点和表达调控模式是开展RNA病毒反向遗传学研究的基础[7]。随着分子生物学的发展，这项技术随后也应用于DNA病毒的研究，病毒DNA可以直接进入细胞合成感染性病毒粒子。1976年研究人员通过在体外转染突变过的猴空泡病毒40 (Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40，SV40)DNA实现了“体外拯救”[8]。1978年，科学家们将QB噬菌体全长cDNA克隆到载体上并转染大肠杆菌，成功拯救出具有感染性的子代噬菌体[9]。这一突破性进展为其他RNA病毒的反向遗传学研究奠定了基础。1981年，脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)感染性克隆的成功构建拉开了动物RNA病毒反向遗传学研究的序幕[10]。

相对于DNA病毒和正链RNA病毒，负链RNA病毒的反向遗传学研究比较滞后。由于其基因组RNA不是复制、转录和翻译的模板，必须与核衣壳蛋白、RNA依赖性RNA聚合酶等形成核糖核蛋白复合物(RNPs)，才能进行正常的复制，完成病毒粒子的包装，而这在体外是难以实现的。除此之外，构建负链RNA病毒的全长cDNA必须明确基因组末端序列。综上所述，体外拯救具有感染性的负链RNA病毒存在一定难度[11-12]。直到1989年，Luytjes W等成功拯救出一种嵌合的流感病毒，打开了负链RNA病毒反向遗传学研究的大门[13]。

3 PPRV反向遗传学研究进展

关于MV、RPA、CDV的反向遗传操作系统的研究早已见诸报道[14-16]，而PPRV反向遗传操作系统的建立则相对较晚。2007年Bailey D等人[17]构建了小反刍兽疫病毒微型基因组系统，这一体系证实了PPRV反向遗传操作系统的可行性，并且证明了PPRV不像其他副粘病毒一样严格遵守“六碱基原则” 。微型基因组一般保留病毒的顺式作用元件和调控区(一般为病毒基因组两端非编码区)，多使用GFP、CAT、X-gal等报告基因代替中间编码区，而且都是将报告基因反向连入启动子下游，以避免非特异性表达。PPRV体外拯救基本元件包括反基因组转录全长cDNA载体以及三个反式作用辅助病毒蛋白：核衣壳N，磷蛋白P和大蛋白L。Yununs等人建立了PPRV体外转录系统，该系统可以在体外持续地转录出病毒所有蛋白的mRNA，并表现出梯度转录特性，与病毒自然感染细胞的情况相似[18]。翟军军[19]构建了PPRV全长cDNA克隆，进行了PPRV DNA疫苗的研发和免疫学研究。直到2012年，Hu等人[20]通过RNA聚合酶II启动子驱动病毒全长基因组转录的方式，第一次成功地从PPRV全长cDNA克隆中拯救出了能稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒，其体外复制能力与亲本病毒相当。2015年Muniraju M等人[21]也成功拯救出PPRV，该拯救系统采用人工合成的质粒，包含全长PPRV反基因组序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列。该研究通过插入EGFP基因获得了阳性标记的重组病毒，通过突变H基因上C77位点获得了阴性标记的重组病毒，为PPRV鉴别感染和免疫(DIVA)标记疫苗的研发提供了新的思路和方法。在上述两个成功拯救PPRV的系统中，亲本毒均为PPRV Nigeria 75/1 疫苗株，被拯救的重组PPRV病毒与亲本毒在Vero细胞上的生长曲线没有明显差别且产生相同的细胞病变(CPE)。Hu等人重组rPPRV-GFP病毒通过病毒中和试验(VNT)可以更快速、更高通量地检测PPRV中和抗体效价。Muniraju M等用重组病毒候选疫苗(rPPRV-C77)与亲本毒疫苗同时免疫山羊，都对致死剂量的PPRV攻击提供了完全保护。2019年Liu F等人[22]也建立了PPRV反向遗传系统，拯救的PPRV能在体外高效表达EGFP。研究通过检测表达EGFP的细胞比例，比较了BHK21、F81、MDBK、RK13、MDCK、PK15、Vero和GT等8个哺乳动物细胞系对拯救病毒的易感性，最终确定Vero最易感，PK15最不易感。

研究者根据副粘病毒基因组遗传稳定的特点，常利用反向遗传技术制备重组副粘病毒载体疫苗和DIVA疫苗，已成为当今疫苗研发的重要方向。胡倩倩等人[23]构建了能够表达蓝舌病毒VP5和VP7蛋白的重组PPRV，接种山羊可诱导产生针对BTV和PPRV的抗体。Yin C等人[24]构建了能够表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组PPRV(rPPRV/VP1)，rPPRV/VP1接种山羊后对口蹄疫病毒的攻击产生明显的保护，结果表明rPPRV/VP1可作为PPRV和FMDV活载体疫苗的候选株。虽然已有成功建立的PPRV反向遗传系统，但至今未有公开报道拯救出的PPRV应用在PPR的防控和疫病的根除。

4 PPRV拯救策略

4.1 副粘病毒反向遗传操作系统的分类目前，副粘病毒反向遗传操作系统主要分为两种：一种是基于T7 RNA聚合酶建立的反向遗传操作系统，另一种是基于RNA聚合酶II建立的反向遗传操作系统。两个操作系统的建立都必须以转录出精确的全长序列为基础。研究表明，负链RNA病毒在体外进行拯救的过程中，病毒基因组前导序列和尾部序列的突变会影响RNA的转录和复制，两端的非编码区在病毒的转录和复制中起着关键性作用。研究人员构建副粘病毒基因组全长cDNA克隆时，为避免外来核苷酸在体外转录过程中插入RNA模板的5’端和3’端，会在两端引入具有自我剪切功能的核酶序列。比如在病毒序列5’端和3’端分别引入丁肝核酶(HDVRZ)和锤头状核酶(HHRZ)，两种核酶转录完成后，可分别在5’首端碱基之前和3’末端碱基之后发生特异性剪切，从而得到完整且准确的基因组末端序列[25-26]，此方法在拯救负链RNA病毒中应用较为广泛。

T7 RNA聚合酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶，其对噬菌体T7启动子序列具有高特异性，能够特异性地转录位于T7启动子下游的的DNA。在副黏病毒的反向遗传学研究中，通常在病毒基因组cDNA的5’端插入T7启动子，这就要求宿主细胞提供T7 RNA聚合酶以配合转染质粒在细胞内转录。因此需要筛选出能稳定表达T7 RNA聚合酶的特定细胞系，或者利用重组的T7 RNA聚合酶痘苗病毒提前感染宿主细胞获得外源性T7 RNA聚合酶。以上策略操作复杂且转染细胞易受干扰，尤其对拯救具有严格细胞适应性的病毒而言影响更大。

为了解决上述问题，研究人员开发了一个基于人巨细胞病毒(CMV)启动子的系统，即在病毒基因组cDNA的5’端插入CMV启动子代替T7启动子，利用真核细胞自身表达的RNA聚合酶II直接识别CMV启动子。CMV系统的优点是避免产生由于引入外源性T7 RNA聚合酶而引起宿主细胞发生CPE，或由于增加了共转染质粒的数量而降低系统性能的问题。由于RNA聚合酶II位于细胞核的核质内，最初认为驱动CMV启动子的RNA聚合酶II系统用于拯救核复制病毒效果会更好。而后研究表明CMV系统也可用于拯救其他非核复制病毒，如2011年Li等人将NDV的I系苗Mukteswar毒株全长序列分别置于T7启动子和CMV启动子后，都获得了具有感染性的病毒粒子，并且采用CMV启动子拯救系统的拯救效率显著高于前者[27]。至于采用T7启动子还是CMV启动子主要取决于实验室现有的条件，目前市场已有成熟稳定表达T7 RNA聚合酶的细胞系，在极大提高病毒拯救效率的同时也避免了由于引入外源T7 RNA聚合酶辅助拯救病毒而引起的CPE的难题。

4.2 参考NDV的拯救策略在传统的副粘病毒反向遗传学研究中，病毒拯救依赖于将含有病毒基因组全长序列的质粒分别与三个含有N、P和L基因独立克隆的辅助质粒共转染真核细胞。

下面将从副粘病毒科NDV反向遗传学最新研究进展中分析可能用于拯救PPRV的策略，有望促进PPRV反向遗传技术的发展。2008年Gao等人[28]在基于RNA聚合酶I系统之上，将NDV弱毒株B1株三个外部基因和三个内部基因克隆到带有T7启动子的转录载体上，然后将两个含有全长序列的转录载体和三个辅助质粒共转染细胞，拯救出的重组NDV生长特性与亲本毒一致。副粘病毒基因组大小为15～16kb，构建全长cDNA克隆时容易发生突变，如果能将全长基因组分节段克隆到两个质粒进行转录将提高病毒拯救效率。Gao等人[28]的研究为PPRV拯救提供了一条新思路。2020年Wang N等人[29]建立了一种简单可靠的NDV反向遗传操作系统，研究构建的一个NDV基因组全长质粒采用T7启动子驱动，其他三个辅助质粒系统采用CMV启动子驱动，同时构建了一个不使用辅助病毒就能够增强表达T7 RNA聚合酶的质粒，通过五个质粒共转染成功拯救出重组NDV病毒。

2017年Liu等人[30]开展了双质粒拯救系统的研究，双质粒系统是一种新方法，其创新点在于构建了一个辅助质粒，其中包含了可编码三个病毒复制所需蛋白(N、P和L)的翻译盒，每个翻译盒都有一个合适的启动子(T7或CMV)和终止子(T7T或Poly-A tail)，根据拯救策略的不同，可选择性地使用或不使用外源性T7 RNA聚合酶。另外，研究人员还构建了病毒全长反基因组的质粒，将其与辅助质粒共转染到细胞中，拯救出感染性病毒。与传统的四质粒系统相比，双质粒系统具有更高的拯救效率，并且适用于四质粒系统无法拯救的病毒[30-31]。

除了以上多质粒拯救系统外，还有基于单质粒的拯救系统。单股负链RNA病毒的反向遗传操作系统的建立依赖于含有病毒基因组全长cDNA的质粒和含有病毒复制相关基因的辅助质粒进行共转染。Peeters B[32]提出了一种新的拯救策略，即利用单个质粒拯救NDV，无需使用辅助质粒。这种方法是将T7或CMV启动子序列插入或替换病毒复制基因的亚基因组RNA的非编码区，位置的选择应确保编码病毒复制必要蛋白的亚基因组RNA转录，从而形成RNPs复合物，同时还要避免干扰病毒基因组中增强下游基因表达的基本元件。由于病毒复制策略的相似性，单质粒系统理论上也可适用于大多数非节段负链RNA病毒。

目前，对已经拯救出的PPRV反向遗传系统进行分析，科研人员均采用四质粒拯救体系，其中Hu等人采用CMV启动子对病毒进行拯救，直接将质粒转染到PPRV易感细胞中，完成病毒组装释放；而Muniraju M和Liu F等人则采用T7启动子对病毒进行拯救，将质粒转染到改造过带有T7聚合酶的真核细胞系中，完成病毒的组装。PPRV反向遗传技术的应用大多集中在将一段外源基因插入PPRV基因组中，做成基因联苗。由于PPRV反向遗传操作系统尚不成熟，病毒拯救困难。因此，建立稳定可靠的PPRV反向遗传操作系统对研究其致病机制十分重要。

5 展望