禽网状内皮组织增生症病毒和A亚群禽白血病病毒共感染对疫苗免疫鸡生长性能和免疫器官的影响

黄小洁，刘 丹，孔冬妮，张 兵，吴华伟，薛 麒，杨 飞，侯力丹，薛青红，李俊平*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081; 2.中牧实业股份有限公司；农业部兽用生物制品与化药重点实验室；北京市兽用多肽疫苗设计与制备工程技术中心，北京 100095)

禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)和禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)同属于反转录病毒科，分别属于γ反转录病毒属和α反转录病毒属。这两种病原有共同的致病特性，即均可引起肿瘤，小日龄感染容易产生免疫耐受，易引起长期的病毒血症及造成免疫抑制等。临床中常见REV与ALV共感染的报道[1-3]，而且这两种病毒也是污染兽用生物制品的常见外源病毒，因此更加重了临床中共感染的可能。目前市场上还没有针对REV和ALV的商品化疫苗，由于这两种病毒均不引起鸡群明显的死亡，因此二者对鸡群的危害常常被养殖户忽视。

近年来，有关ALV-J的报道较多，ALV-J与REV的共感染研究亦有大量报道，研究结果表明ALV-J与REV共感染对鸡的致病性有明显的协同作用[4-5]。2006年，在美国市场上使用的马立克氏病疫苗中曾检测出ALV-A污染；我国研究团队也在国内市场上多个不同品种的鸡胚或种鸡中分离到了ALV-A[6-7]。与此同时，国内外禽用疫苗中仍有污染REV的报道，所以有必要开展REV与ALV-A共感染研究。本实验通过人工感染的方式，使SPF鸡单感染或共感染这两种病毒，再进行疫苗免疫，对实验鸡的生长性能和免疫器官进行检测和比较分析，观察REV与ALV-A单感染或者共感染后对疫苗免疫鸡的生长性能和免疫器官的影响，以为其防治提供理论支撑和实践指导。

1 材料与方法

1.1 病毒株 REV MD-2，分离自一污染的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒冻干活疫苗，中国兽医药品监察所病毒制品检测一室鉴定保存；ALV-A毒株SDAU09C1株，分离自引进的白羽肉用型祖代鸡，山东农业大学崔治中教授馈赠。

1.2 细胞 鸡胚成纤维细胞(CEF)，自北京梅里亚维通试验动物技术有限公司购入SPF鸡胚，按《中华人民共和国兽药典》附录方法制备；DF1细胞，从美国菌种保藏中心(ATCC)购入。

1.3 疫苗 鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗(Fc-126株)，鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)，中国兽医药品监察所病毒制品检测一室制备检定。鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(LaSota+H120株)，禽流感(H5+H9)二价活疫苗(H5 N1Re-5+H9 N2Re-2株)国内企业生产；鸡新城疫、传染性支气管炎、病毒性关节炎及传染性法氏囊病四联灭活疫苗，国外企业生产。所有疫苗在进行免疫之前测定病毒含量和外源病毒检测。

1.4 实验动物 所有SPF鸡均购自北京梅里亚维通试验动物技术有限公司。

1.5 1日龄SPF鸡REV与ALV-A共感染对常规疫苗免疫鸡群的影响 1日龄SPF鸡175只，平均分成5组。1日龄时，REV单感染组、ALV-A单感染组、REV+ALV-A共感染组分别经皮下注射REV MD-2病毒液0.2 mL(含500 TCID50)、ALV-A SDAU09C1病毒液0.2 mL(含500 TCID50)、REV MD-2和ALV-A SDAU09C1病毒混合液0.2 mL(各含250 TCID50)。疫苗免疫程序如下：1日龄时，各感染组和免疫对照组SPF鸡每只经颈部皮下注射鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗0.2 mL(含1羽份)；5日龄时，滴鼻接种新支二联活疫苗0.1 mL(含1羽份)；10日龄时，滴眼免疫IBD活疫苗(B87株)0.1 mL(含1羽份)；17日龄时，皮下注射ND-IB-REO-IBD四联灭活疫苗0.3 mL(含1羽份)；20日龄时，皮下注射禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗0.3 mL(含1羽份)。同时设空白对照组，各时间段免疫均用生理盐水代替。各组鸡在5、10、15、20、25日龄时各取4只，每只称重，并采集法氏囊、胸腺、脾脏称重，其余鸡继续饲养。35、45、65日龄时全部鸡称重，75日龄称重淘汰。

1.6 10日龄SPF鸡REV与ALV-A共感染对常规疫苗免疫鸡群的影响 选取1日龄SPF鸡100只，分组和疫苗免疫程序同1.5项。REV单感染组鸡于10日龄时皮下注射REV MD-2病毒液0.2 mL(含500 TCID50)，ALV-A单感染组鸡于10日龄时每只经皮下注射ALV-A SDAU09C1病毒液0.2 mL(含500 TCID50)，REV+ALV-A共感染组鸡于10日龄时每只经皮下注射REV MD-2和 ALV-A SDAU09C1病毒混合液 0.2 mL(各含250 TCID50)。每组鸡于第5、10、20、25日龄时各取4只，逐只称重并采集法氏囊、胸腺、脾脏称重，剩余鸡继续饲养。35日龄、45日龄、65日龄时各组全部称重，81日龄时称重 后淘汰。

1.7 REV与ALV-A共感染对灭活疫苗免疫鸡群的影响 1日龄SPF鸡150只，平均分5组。1日龄时REV单感染组、ALV-A单感染组、REV、ALV-A共感染组注射与1.5项相同的病毒。灭活疫苗免疫程序如下：7日龄时，各感染组与免疫对照组鸡经颈部皮下注射ND-IB-REO-IBD四联灭活疫苗0.3 mL(含1羽份)；14日龄时，颈部皮下注射禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗0.3 mL(含1羽份)；空白对照在各免疫时段注射灭菌生理盐水。各组鸡在35日龄、65日龄、107日龄、131日龄称重。

1.8 REV与ALV-A共感染对活疫苗免疫鸡群的影响 1日龄SPF鸡120只，平均分为4组，空白对照组和1.7项试验共用。1日龄时REV单感染组、ALV-A单感染组、REV+ALV-A共感染组注射与1.5项相同的病毒。活疫苗免疫程序如下：1周龄时，滴鼻接种新支二联活疫苗(La Sota株+H120株)0.1 mL(含1羽份)；2周龄时，滴眼免疫IBD活疫苗(B87株)0.1 mL(含1羽份)；7周龄滴鼻免疫新支二联活疫苗(La Sota株+H52株)0.1 mL(含1羽份)。

1.9 数据处理 记录每组试验鸡发病和特异性死亡情况。以每次采样各组体重的平均数分别绘制1.5项-1.8项试验中各组的体重增长曲线。免疫器官分别计算每只鸡的法氏囊、胸腺、脾脏重量与体重的比值，然后通过t-test统计分析各采样时间点各组间法氏囊比重、胸腺比重及脾脏比重的差异。

2 结果与分析

2.1 REV与 ALV-A共感染对免疫鸡生长性能的影响

2.1.1 1日龄感染对常规免疫鸡生长性能的影响共感染组特异性死亡5只，另4只明显矮小，发病及死亡率为25.7%；REV单感染组特异性死亡3只，另5只明显矮小，发病及死亡率为22.8%；ALV-A单感染组死亡2只，另2只体重明显减轻，发病及死亡率为11.4%。体重分析结果见表1，感染组于20日龄开始，体重明显低于免疫对照组，且共感染组体重下降更加明显；在 35～75日龄间，REV单感染组和共感染组体重显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于免疫对照组与空白对照组。

表1 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的体重变化

Note：* Different capital letters at the right -top corner indicate extremely significant differences (P<0.01). Different small letters at the right-top corner indicate the significant differences (P<0.05). Different number of “*” at the top right corner indicate the significant differences (P<0.05). Same marker or no marker at the right -top corner indicate no significant differences (P>0.05)

2.1.2 10日龄感染对常规免疫鸡生长性能的影响共感染组特异性死亡2只，另有4只症状明显，病死率为20%；REV单感染组死亡2只，另2只发病，病死率为13.3%；ALV-A单感染组无死亡，有2只发病，发病率为6.7%。体重分析结果见表2，各感染组鸡于35日龄时体重均显著低于免疫对照组(P<0.05)，极显著低于空白对照组(P<0.01)；45～81日龄，各感染组体重一直低于免疫对照组，但只有共感染组差异显著(P<0.05)，与此同时，共感染组还低于各单感染组，但差异不显著。这表明，10日龄鸡REV与ALV-A单感染及共感染对鸡生长性能有显著影响，共感染的影响大于单感染。

表2 10日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的体重变化

2.1.3 1日龄感染对灭活疫苗免疫鸡生长性能的影响 共感染组死亡9只，另2只矮小，病死率36.7%；REV单感染组死亡8只，另有1只矮小，病死率为30%；ALV-A单感染组死亡2只，另有1只瘦小，病死率为 10%；免疫对照意外死亡1只。体重分析见表3，整个试验期间，共感染组一直低于其他各组，35日龄、65日龄时分别显著、极显著低于ALV-A单感染组，试验期间一直与REV单感染组间无显著性差异；REV单感染组于35日龄、65日龄时体重极显著低于对照组(P<0.01)，之后仍一直低于对照组，但差异不显著，65日龄时显著低于ALV-A单感染组；ALV-A单感染组35日龄时极显著低于对照组(P<0.01)，之后也一直低于对照组，但差异不显著。

表3 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染灭活疫苗免疫鸡的体重变化

2.1.4 1日龄感染对活疫苗免疫鸡生长性能的影响共感染组特异性死亡9只，另有1只矮小，病死率达33.3%；REV单感染组死7只，另有2只矮小，病死率为30%；ALV-A单感染组死亡2只，另有2只瘦小，病死率为13.3%。表4显示，共感染组在35～107日龄时差异极显著(P<0.01)低于其他各组，131日龄时差异显著(P<0.05)低于对照组和ALV-A单感染组，三个感染组在65～107日龄时差异极显著(P<0.01)两个对照组，而且共感染组在35日龄、65日龄时还极显著低于两个单感染组(P<0.01)，而两个单感染组在整个试验期间都差异不显著。

表4 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染活疫苗免疫鸡的体重变化

2.2 REV与ALV-A共感染对免疫鸡免疫器官比重的影响

2.2.1 对胸腺比重的影响 1日龄鸡单感染或共感染 REV与ALV-A后，常规疫苗免疫，对鸡胸腺比重的影响(表5)，REV单感染组在20～45日龄显著低于两个对照组和ALV-A单感染组(P<0.05)，但差异不显著；共感染组在 20～45日龄一直极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)低于其他组，并在 20～45日龄高于REV 单感染组，但差异不显著；且在25～45日龄显著低于 ALV-A单感染组(P<0.05)，并低于共感染组，但差异不显著；ALV-A单感染组与对照组间无显著性差异，对胸腺比重的影响不显著。

表5 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的胸腺比重变化

10日龄鸡单感染或共感染REV与ALV-A，常规疫苗免疫，其胸腺比重分析结果(表6)显示，在整个试验期间所有组间均差异不显著。有ALV-A单感染组显著高于空白对照组，其余各组间差异均不显著。

表6 10日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的胸腺比重变化

2.2.2 对法氏囊比重的影响 1日龄鸡感染后(表7)，10日龄开始，三个感染组和免疫对照组一直低于空白对照组，在20日龄时REV单感染组和共感染组显著低于空白对照组(P<0.05)，25日龄时其他各组均极显著低于空白对照组(P<0.01)，45日龄时，REV单感染组和共感染组极显著低于空白对照组(P<0.01)，显著低于免疫对照组及ALV-A单感染组(P<0.05)。试验过程中，ALV-A单感染组与免疫对照组间一直无显著性差异。

表7 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的法氏囊比重变化

10日龄鸡感染后(表8)，35日龄检测时，三个感染组均极显著低于空白对照组(P<0.01)，免疫对照组显著低于空白对照组(P<0.05)，各感染组低于免疫对照组，但差异不显著，ALV-A单感染组略高于REV单感染组和共感染组；45日龄时，REV单感染组和共感染组极显著低于空白对照组(P<0.01)，显著低于免疫对照组(P<0.05)。ALV-A组法氏囊比重与其他各组均无显著性差异，REV单感染组与共感染组间亦无显著性差异。

表8 10日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的法氏囊比重变化

2.2.3 对脾脏比重的影响 1日龄鸡感染时脾脏比重分析结果(表9)显示，各感染组和免疫对照组在5日龄时显著高于对照组(P<0.05)，10日龄时极显著高于空白对照组(P<0.01)；20日龄时共感染组和免疫对照组极显著高于空白对照组(P<0.01)，REV单感染组和ALV-A单感染组显著高于空白对照组(P<0.05)。

表9 1日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的脾脏比重变化

10日龄鸡感染时，脾脏比重分析结果(表10)显示，各感染组和免疫对照组都极显著高于空白对照组(P<0.01)，且各组间无显著性差异；在35日龄时，仅ALV-A单感染组显著高于空白对照组(P<0.05)，其他各组间均差异不显著，45日龄时各组间差异都不显著。

表10 10日龄REV与ALV-A单感染及共感染常规免疫鸡的脾脏比重变化

3 讨 论

REV和ALV是鸡群中常见的两种可以垂直传播的免疫抑制性病毒，其单独感染或者共同感染后导致的免疫抑制问题一直备受关注，由此造成的疫苗免疫失败给养禽业带来巨大的经济损失。免疫器官是动物执行免疫功能的组织机构，它们的发育状况直接影响到机体免疫力的高低[8]。免疫抑制是指由于各种因素作用，使机体对抗原的应答能力低下甚至丧失的现象[9]。REV本身对禽的致死力不明显，但其能够损害机体的免疫系统，使机体的免疫功能下降，从而易遭受其他病原的侵袭[10]。有研究表明，REV与ALV-J共感染在致病性方面有明显的协同作用，可引起体重下降、免疫器官损伤严重等情况[11]。而REV与ALV-A共感染对免疫鸡群的影响，一直缺乏系统的研究数据。本研究在有免疫刺激的情况下，探讨REV与ALV-A共感染对鸡生长发育、免疫器官等方面的影响。

本研究表明，在常规免疫、灭活疫苗及活疫苗免疫三种免疫情况下，无论是1日龄鸡还是10日龄鸡单感染REV或共感染REV和ALV-A均会引起发病和死亡，而且严重程度高于非免疫情况。疫苗免疫会加重 REV与ALV-A感染，感染日龄越小对感染的敏感性越高，而且共感染有明显的协同致病作用。REV与ALV-A 单感染或共感染对体重的影响更加明显，常规免疫可在短期内(65日龄前)引起鸡只体重明显下降。其中REV单感染和与ALV-A共感染对体重下降的影响明显较ALV-A 单感染严重，下降幅度更大，持续时间也较长。此外本研究还表明，在病毒感染的情况下，活疫苗免疫引起的鸡体重下降比灭活疫苗免疫更加严重。

1日龄感染时，无论是REV单感染还是共感染都会引起胸腺比重的下降，免疫对照组和ALV-A单感染组与空白对照组差异不显著。10日龄感染时，所有组与空白对照组的差异均不显著，这表明鸡日龄越大受感染后对胸腺的影响越小。常规疫苗免疫时法氏囊比重显著或极显著低于空白对照组，原因是10日龄时免疫鸡法氏囊病活疫苗(B87株)，活疫苗刺激加重了法氏囊的萎缩，之后该组法氏囊比重与空白对照组差距逐渐缩小，说明正常免疫造成的萎缩可以在一定程度上恢复。1日龄鸡 REV 单感染或共感染加重了法氏囊比重的下降，20日龄时REV单感染组和共感染组法氏囊比重开始低于其他组，20日龄以后显著或极显著低于其他三组，说明REV感染对法式囊的损伤持久且不可恢复，ALV-A 单感染对法氏囊损伤的影响不明显。与 1日龄 REV 单感染及共感染对法氏囊比重的影响相比，10日龄感染造成的影响相对较小。感染或常规免疫可引起脾脏比重非特异性增高，免疫对照组和REV单感染组对脾脏比重的影响没有ALV-A单感染和共感染组大。疫苗免疫或感染均引起脾脏比重的升高，REV 与 ALV-A 单感染和共感染与免疫对照组间无显著性差异。

综上研究表明，REV、ALV-A单感染或共感染都会引起生长发育迟缓，消瘦，引起胸腺、法氏囊的萎缩，脾脏的肿大，而且REV单感染或共感染对这些的影响远大于ALV-A的影响，尤其是在疫苗免疫的情况下影响更重。可以看出REV感染造成的症状、病理损伤和免疫抑制现象更为显著，在共感染或是疫苗免疫情况下对鸡群的伤害更大。陈瑞爱做过REV和ALV-J对鸡获得性免疫影响的研究，结果与本实验基本一致[12]。由此可见，在活疫苗生产中如果疫苗污染了REV等外源病毒，对鸡群造成的影响甚至比单一感染更严重。因此，严格把控外源病毒污染是活疫苗生产过程中必须高度重视的关键环节。本研究结果为进一步研究REV和ALV-A单感染或者共感染诱导鸡群发生免疫抑制机制提供了新的数据。