生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用研究进展*

李文强，张新晨

（哈尔滨医科大学附属第二医院 普外科，黑龙江 哈尔滨 150001）

生物钟是生命的基本特征之一，普遍存在于多种生物中，从低等的细菌到真核的真菌、植物、动物到人类都存在生物钟调控系统。哺乳动物的生物钟由中枢生物钟和外周生物钟组成。中枢生物钟位于下丘脑的视交叉上核，外周生物钟存在于各种器官组织中。中枢生物钟通过自主神经支配、体温、激素信号和饮食来调控外周生物钟。从分子水平上看，生物钟系统是由一系列生物钟基因组成，主要有生物钟核心基因Bmal1、Clock、Npas2，负反馈基因Per1-3、Cry1-2，以及靶基因和 钟 控 基 因Nr1d1、Nr1d2、RORα、Dbp、Tef、Nfil3等。随着生物钟研究的逐渐深入，生物钟基因及蛋白在抗炎及免疫调节中的作用逐步被发现，本文简单介绍生物钟通路，并重点讨论生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中的作用，以及针对Rev-erb和ROR靶向配体的研究及应用。

1 生物钟通路

生物钟系统是一个层次网络[1]。这个层次的顶部是视交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN），SCN位于下丘脑前部，接受光信息促进松果体褪黑激素分泌、肾上腺皮质酮释放、调节体温和睡眠-觉醒周期的节律，充当一个“指挥者”，为生物钟系统提供主要的时间线索[2]。SCN通过神经元和体液信号同步机体大多数器官和组织细胞中运作的局部时钟振荡器，影响全身昼夜生理学和行为[3]。

在细胞水平上，生物钟的基因和蛋白以转录-翻译反馈回路表达，周期约为24 h。第一个生物钟反馈调节机制：Bmal1和Clock形成一个异二聚体，激活Per1、Per2和Cry1、Cry2的转录，当Per和Cry蛋白到达关键值时抑制Bmal1-Clock二聚体对自身基因的激活以结束这个循环。在Per和Cry蛋白降解后再次开始一个新的昼夜循环，重新开始Bmal1-Clock介导的转录激活[4]。第二个生物钟反馈调节机制：Bmal1-Clock异二聚体转录控制启动子序列中含有E-box元件的核激素受体Rev-erbα（Nr1d1）、Reverbβ（Nr1d2）及RORα、RORβ和RORγ，转录出RORs蛋白和Rev-erbs蛋白在Bmal1基因的启动子序列中竞争结合ROR元素（RORe）。RORs蛋白的结合增加Bmal1的转录，Rev-erbs蛋白的结合能抑制这种反应[5]，由于表达模式及靶基因的大量重叠，Rev-erb和ROR通常参与调节相似的生理过程。

2 Rev-erb在抗炎及免疫调节中的研究

2.1 Rev-erb通过调节炎症因子表达发挥抗炎作用

有研究[6]发现，Rev-erb过表达抑制与类风湿关节炎相关的炎症因子IL-6、TNF-α、CCL-2和MMP-9的表达。有动物实验[7]发现Nr1d1-/-小鼠中Cx3cr1和MMP-9 mRNA表达升高，而Rev-erbα过表达促使Cx3cr1和MMP-9 mRNA表达下降。在巨噬细胞中，Rev-erbα通过结合小鼠CCL-2启动子中的近端元件下调CCL-2的表达[8]，从而介导水泡性口炎病毒诱发脑炎模型中病毒感染的昼夜敏感性[9]。Rev-erbα能够与组蛋白脱乙酰酶3（HDAC3）结合，并与DNA的一个由HDAC3和核受体辅助抑制因子（NCOR）组成抑制复合物，负性调节IL-6等炎症因子的基因表达[7]。综上所述，Rev-erb作为多种炎症因子的负性调节因子发挥抗炎作用。

2.2 Rev-erb通过抑制NFκB/Nlrp3发挥抗炎作用

Rev-erbα在体外和体内调节小胶质细胞激活，Rev-erbα功能丧失促进体内自发性神经炎症和神经元功能障碍。研究[10]发现，小鼠海马中Rev-erbα缺失导致小胶质细胞免疫反应性的节律被破坏，并使脑小胶质细胞锁定在促炎状态；染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明，Rev-erbα与NF-κB信号传导转录物的启动子区域相互作用，Rev-erbα缺失导致培养的小胶质细胞和小鼠海马中的促炎性NF-κB活化。在Raw264.7细胞荧光素酶报告分析、电泳迁移率转移分析（EMSA）和芯片序列中，Reverbα与p65启动子中的REV反应元件直接结合降低总胞浆和核p65水平[11]。Rev-erbα还通过与NLRP3和IL1b的启动子区域结合，负调节NLRP3炎症小体的表达[12]。在Nr1d1缺陷小鼠和人巨噬细胞中发现NLRP3的表达及其复合物的激活与Nr1d1的表达呈负相关，随时间变化，在深夜达到高峰，Reverbα激活可抑制LPS诱导的急性腹膜炎和肝炎的NLRP3炎症途径[12]。抑制NF-κB/NLRP3轴可能是Rev-erbα介导抗炎的一种机制。

2.3 Rev-erb通过诱导巨噬细胞分化发挥抗炎作用

Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬细胞结合位点的全基因组分析显示，这些受体参与了复合物靶基因的调控，提示Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬细胞中起重要作用；巨噬细胞能够极化成具有不同表型和生理功能的促炎M1或抗炎M2状态。敲除造血细胞中的Nr1d1，然后将骨髓移植到LDL受体（LDLR）无效的小鼠中，发现这些小鼠的动脉粥样硬化斑块增加，但脂质水平未受影响[7]。这种作用源于巨噬细胞功能的改变，Rev-erbα的过表达导致巨噬细胞转录水平降低[6]及抗炎M2巨噬细胞水平的升高[13]，进而发挥抗炎作用。

2.4 Rev-erb通过抑制Th17细胞发育发挥抗炎作用

Rev-erbα与Th17细胞中的RoR反应元件结合，抑制包括RoRγ在内的依赖于RoRα的基因表达。研究发现，提高Rev-erb mRNA的表达或用合成的Rev-erb激动剂治疗可通过降低Th17细胞水平，显著延缓实验性自身免疫性脑脊髓炎的发生、发展[14]。相反，Rev-erbα丢失则导致CD3+T细胞Nfil3的表达升高，进而使RORγT细胞诱导IL-17表达并促进Th17细胞的发育[15]。这些结果提示，抑制自身免疫性疾病中的Th17细胞分化发育可能是Rev-erb发挥抗炎作用的一种机制。

2.5 Rev-erb蛋白通过稳定性的动态变化发挥炎症调节作用

Rev-erb蛋白在抑制未受挑战的细胞内源性促炎机制中发挥动态平衡作用。其中，Rev-erbα起主导作用。在炎症反应的形成过程中，促炎细胞因子通过SUMO化和泛素化，引起Rev-erbα蛋白稳定性显著变化和降解增加。炎症信号促进Reverbα的降解提供了一条新途径来解释慢性炎症疾病中的昼夜节律破坏与先天免疫间的联系，增加Rev-erb蛋白稳定性药物的研究可能为一种新型抗炎途径[16]。

2.6 Rev-erb依赖其DNA结合域发挥抗炎作用

清除小鼠支气管上皮细胞中的Rev-erbαDNA结合域后，支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞反应显著[16]。这表明Rev-erbα的另一种抗炎作用依赖于其DNA结合域。

3 ROR在抗炎及免疫调节中的研究

3.1 ROR通过调节炎症因子表达发挥抗炎作用

RORα缺乏的小鼠（RORα-/-）存在严重的共济失调神经元表型，其支气管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）水平较高，气管内滴注脂多糖（LPS）后更易致死[17]。RORα在淋巴细胞发育中起关键作用，RORα-/-小鼠由于B细胞和T细胞间室发育严重缺陷导致脾脏和胸腺细胞生成减少，在T细胞依赖性抗原免疫中，CD8型T细胞在T细胞受体刺激和IgG水平升高后表现出IFN-γ增加。RORα-/-小鼠肥大细胞和巨噬细胞中TNF-α和IL-6表达增加，表明RORα以亚群特异的方式作为炎症细胞因子的负调节因子[18]。

3.2 ROR通过上调IκBα发挥抗炎作用

RORα还被证明与IκBα——B细胞抑制物α中Kappa轻多肽基因增强子的核因子、启动子区域的ROR元件结合，上调IκBα转录，抑制NF-κB信号途径，进而导致p65核移位减少和靶基因转录减少[19]。因此，RORα负性调节细胞因子诱导的炎症反应。

3.3 ROR通过诱导巨噬细胞分化发挥抗炎作用

巨噬细胞中的RORα保持静息、非激活状态，防止早期先天性免疫反应[18]。在巨噬细胞中过表达RORα，可以通过激活磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）增加M2巨噬细胞标志物（Arg1、YM1和Fizz1）基因和蛋白的表达，进而诱导巨噬细胞向M2极化，这可能为RORα的一种抗炎机制[20]。

3.4 ROR通过促进Th17细胞发育发挥促炎作用

Th17细胞产生IL-17细胞因子，并在多发性硬化症等自身免疫性疾病中激活炎症反应；Th17细胞的分化依赖于视黄酸受体相关的RORγt[14]。在原始CD4 T细胞中RORγt的过表达驱动诱导Th17细胞的发育，抑制ROR-γt和ROR-α的表达，从而抑制Th17细胞的分化[21]。与之前所述作用相反，ROR可通过促进Th17细胞发育分化发挥促炎作用。

ROR在抗炎及免疫调节中发挥着重要作用，但在具体炎症疾病中发挥的是抗炎还是促炎作用，仍需进一步研究。

4 合成的Rev-erb配体研究

4.1 Rev-erb激动剂：GSK4112

1，1-二甲基乙基N-[（4-氯苯基）甲基]-N-[（5-硝基-2-噻吩基）甲基]甘氨酸盐是第一个合成的Rev-erb靶向配体。最初命名为SR6452，随后被更名为GSK4112。GSK4112是从荧光共振能量转移生化筛选中鉴定出来的。在荧光共振能量转移生化筛选中，GSK4112以浓度依赖的方式增加NCOR肽与Rev-erbα的结合。GSK4112增加核受体辅助抑制因子（NCOR）向Bmal1启动子的募集[22]，同时增加HDAC3募集到G6PC启动子，这可以作为GSK4112对Rev-erb基因作用的一种机制。GSK4112能调节昼夜节律中涉及的几个关键基因的水平，可作为一种潜在的调节昼夜节律的药物[22]。在巨噬细胞中，GSK4112在LPS诱导的内毒素休克中可以减少人巨噬细胞IL-6的释放、降低促炎细胞因子和趋化因子CXCL-11、CCL-2、CXCL-6和IL-19 mRNA的表达[23]。在星形胶质细胞中，使用GSK4112可显著阻断肿瘤坏死因子诱导的CCL-2 mRNA和MMP-9 mRNA的上调，均表明GSK4112具有抗炎作用[24]。GSK4112在腹腔给药后没有良好的药代动力学曲线，在Rev-erb激动方面作用较弱，这限制其作为体内研究Rev-erbs功能的应用[25-26]。

4.2 Rev-erb激动剂：SR9009、SR9011

SR9009和SR9011以GSK4112为初始架构，改善了功效和药代动力学特性（增加全身暴露）。SR9009和SR9011是Rev-erbα和Rev-erbβ的双重合成激动剂，其效能是GSK4112的3～4倍，在驱动Rev-erb方面更有效。研究[27]发现当Rev-erbα表达达到峰值（即在睡眠期的中间）时，给小鼠进行两种化合物的腹腔给药都会导致小鼠清醒后车轮转动活动的丧失；此外，这两种化合物都能影响昼夜节律几种核心时钟基因在小鼠下丘脑的表达改变，包括Cry2的抑制，Per2的增强，Bmal1表达的相移和Npas2昼夜表达模式的消除。这表明SR9009和SR9011通过调节Rev-erb活性对昼夜节律振荡器产生影响。

SR9009或其他人工合成Rev-erbs激动剂可抑制IgE和IL-33介导的肥大细胞激活，并抑制Gab2/PI3K和NF-κB途径。因此，通过合成Rev-erb激动剂对Rev-erb活性的调节可能对广泛的过敏性疾病有潜在的作用[28]。使用SR9009刺激动脉粥样硬化模型小鼠骨髓源性巨噬细胞，可以降低骨髓源性巨噬细胞向促炎M1巨噬细胞的极化，同时增加其向抗炎M2巨噬细胞的极化，这表明Rev-erbs的药理学靶向可能是治疗动脉粥样硬化的一种可行选择[29]。SR9009治疗后，心肌梗死模型小鼠炎症因子IL-6、Mcp1、Ly6g、CD11b、MMP-9 mRNA表达及磷酸化NF-ERKBp65、磷酸化κ、磷酸化p38蛋白表达均明显下降，中性粒细胞浸润程度明显降低。这表明，SR9009治疗是通过调节炎症和重塑过程改善心功能，减少心肌梗死的死亡率[30]。

4.3 Rev-erb拮抗剂：SR8278

SR8278是目前为止唯一一种Rev-erb合成拮抗剂。在基于Gal4的共转染报告实验及由3个Reverb启动子驱动的全长Rev-erbα荧光素酶报告实验中，SR8278提高了Rev-erbα和Rev-erbβ的靶基因活性，包括Bmal1、PCK和G6PC，用SR8278处理HepG2细胞可以增加G6PC和PCK的表达[31]。进一步研究发现GSK4112通过激活Rev-erbα刺激葡萄糖诱导的MIN-6小鼠胰岛素瘤细胞中的胰岛素分泌，SR8278能抑制GSK4112发挥作用[32]。SR8278对Rev-erb活性调节有一定作用，但在免疫调节中的研究仍较少。

5 合成的ROR配体研究

5.1 RORα和RORγ反向激动剂：SR1001

SR1001的发现和报告证明ROR配体可用于探索ROR在小鼠疾病模型中的作用[33]。SR1001抑制RORα和RORγ基因活性，降低受体和共激活剂之间的相互作用。使用SR1001治疗动脉粥样硬化模型小鼠，诱导了一种抗动脉粥样硬化的免疫模式，其特征是Th17细胞减少，Treg和Th2细胞增加[34]。这种抑制与IL-17A细胞因子的表达下调相关[35]。TH17细胞可能是1型糖尿病发展的病理因素，SR1001减少了促炎细胞因子的表达，特别是TH17介导的细胞因子，减少了自身抗体的产生，并增加了CD4+Foxp3+T调节细胞的频率，使用针对该细胞类型的ROR特异性合成配体可能会成为一种治疗1型糖尿病的新方法[36]。

5.2 RORγ反向激动剂：SR2211

SR2211是一种在生化和细胞的测定中对RORγ显示出优于RORα的精确选择性的化合物。在EL-4细胞中，SR2211抑制IL-17a和IL-23R的表达，以及下调细胞内IL-17蛋白水平，并抑制TH17细胞分化[37]。动物实验[38]显示SR2211在胶原诱导的类风湿性关节炎模型小鼠中具有活性，通过腹膜注射SR2211，2次/d，持续15 d，能显著减少模型小鼠的关节炎症。

6 小结

生物钟基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫调节中发挥重要作用，其通过影响炎症因子、炎症通路及免疫细胞的表达调节机体免疫反应。目前Rev-erb和ROR的人工合成配体也越来越多，其在免疫调节及相关疾病的治疗潜力已经在免疫相关疾病的动物模型中得到一定证明。未来，进一步改进和优化配体有可能会应用于自身免疫相关疾病的治疗。改善这些人工合成配体药物性质的研究已经取得一定进展，其中一些改进的人工合成配体或其类似物在不久的将来极有可能进入临床试验阶段。