银离子泡沫敷料的亚慢性全身毒性研究

黄燕倩 莫怡飞 向健 张晓丽 卢玉沛 杨立峰 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510080）

内容提要： 目的：比较不同浸提比例下银离子泡沫敷料亚慢性全身毒性试验结果的差异。方法：对两组SD大鼠分别给予不同浓度的银离子泡沫敷料浸提液，综合比较临床观察、体重变化、血液学、血液生化、大体尸检和组织病理学检查结果，观察两组动物的亚慢性全身毒性反应。结果：浸提比例为0.4g/mL的银离子泡沫敷料浸提液，会导致大鼠体重增长缓慢。结论：提高银离子泡沫敷料的浸提比例，可以观测到大鼠全身毒性反应。

研究表明，银离子具有良好的广谱抗菌性，可以有效杀灭细菌、真菌和霉菌，且较少产生抗菌性[1]。利用这一原理，银离子在医疗卫生领域等到广泛的应用，例如在牙科材料、伤口修复和妇科疾病治疗中都发挥着重要作用，而且也常用于导管、支架、硅橡胶等医疗器械[2]。尤其在创伤抗菌敷料上，对外科、多种疾病引起的皮肤溃疡等创面治疗具有突出效果[3]。然而，银离子作为一种金属离子，其抑菌杀菌作用无选择性，在一定浓度下，对生物体正常的细胞也会造成的损伤，对人体依然具有一定的毒性作用[4]。鉴于银离子优秀的抗菌特性，银离子抗菌材料已然成为当今医疗器械研究的热点。如何安全合理地应用银离子，探索其在生物体上引发生物毒性的阈值是值得关注的。本文对银离子敷料两种给药浓度实验结果进行比较，以期对银离子敷料这一类医疗器械的全身毒性研究提供一定的参考。

1.材料与方法

1.1 一般材料

本实验起止时间：2021年3月～2021年11月。

供试品液制备：取银离子泡沫敷料，除吸水容量外分别按0.1g/mL和0.4g/mL的比例加入生理盐水，37˚C下放置72h，取浸提液作为供试品。浸提比例为0.1g/mL的浸提液设为A液，浸提比例为0.4g/mL的设为B液。生理盐水作为对照液。

实验动物：检疫合格的SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，雌性未产并无孕。动物来源：广东省医学实验动物中心。

1.2 方法

设置A、B两组实验，每组各40只动物，雌雄各半，雌性未产并无孕。随机分配为对照组和观察组。A、B两组观察组动物按10mL/kg的比例分别皮下注射给予浸提比例为0.1g/mL和0.4g/mL的浸提液。对照组动物均按照10mL/kg的比例皮下注射给予生理盐水。连续注射90d后，分别比较观察组A与对照组A、观察组B与对照组B动物的各项指标，比较给予不同浓度浸提液大鼠的全身毒性反应。实验设计如表1所示。

表1.实验设计

实验期间每天观察并记录动物的一般状态和毒性表现。于实验开始时、实验开始后每周及安乐死前记录动物体重。实验终期经腹主动脉采血后进行血液常规和血生化检测。采血后对动物进行大体剖检，及时称量记录各主要脏器的湿重，并进行组织病理学检查。

1.3 观察指标

比较临床观察、体重变化、血液学、血液生化、大体尸检和组织病理学检查结果，观察两组动物的亚慢性全身毒性反应。分析浸提液浓度与受试动物异常指标产生的相关性。

1.4 统计学分析

采用SPSS统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 临床观察

实验期间，各组大鼠外观、一般状态和行为活动未见明显异常。

2.2 动物体重

在B组实验中，观察组动物在实验中后期体重增长速度明显较对照组缓慢，且经统计学分析观察组动物体重与对照组相比存在统计学差异。与对照组相比较，观察组雌性动物体重在实验第49天和第56天有显著差异（P<0.05），第63天起至实验结束，有极显著差异（P<0.01）；观察组雄性动物体重在第21天、第28天和第35天有显著差异（P<0.05），第42天起至实验结束，有极显著差异（P<0.01）。在A组实验中，观察组与对照组相比较，雌性动物体重未见统计学差异，雄性动物在实验第84天有显著差异（P<0.05），在第90天有极显著差异（P<0.01）。各组实验动物体重变化见图1。

图1.各实验组动物体重变化趋势

2.3 血液学数据分析

A组实验中，与对照组同性别动物相比较，观察组雌性动物血小板（Platelet，PLT）升高，雌雄性动物白细胞（WhiteBlood Cell，WBC）均降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。在B组实验中，与对照组同性别动物相比较，观察组雄性动物红细胞（Red Blood Cell，RBC）降低。A、B两组实验中其他血液学指标无统计学意义的差异（P>0.05）。以上统计学差异主要由个别数值偏差加大引起，临床观察未见动物异常反应，故认为差异无毒理学意义。见表2。

表2.血液数据(n=10,±s)

表2.血液数据(n=10,±s)

注1：凝血酶原时间（Prothrombin Time，PT），平均红细胞体积（Mean Corpuscular Volume，MCV），红细胞压积（Hematocrit，HCT），血红蛋白（hemoglobin，HGB）注2：与同一时期对照组同性别动物相比，aP<0.05，表示统计学上有显著差异，bP<0.01，表示有极显著差异；无标记即为P>0.05，表示无统计学差异

指标 雌性 雄性 雌性 雄性对照组A 观察组A 对照组A 观察组A 对照组B 观察组B 对照组B 观察组B PT(S) 8.2±0.4 8.3±0.5 11.4±4.1 9.7±1.4 8.44±0.33 8.14±0.42 9.34±0.56 9.06±0.43 RBC(×1012/L) 8.73±0.50 9.18±0.58 10.08±0.42 10.03±0.58 8.00±2.84 8.81±0.46 10.27±0.37 9.80±0.33b MCV(fL) 51.1±1.2 51.2±2.0 47.1±1.6 48.1±1.6 53.5±4.7 51.5±2.6 47.4±1.2 47.6±1.9 HCT(%) 44.6±2.1 46.9±2.6 47.5±2.2 48.3±3.6 46.3±2.5 45.2±1.4 47.4±2.1 46.6±1.5 HGB(g/L) 159±8 166±9 172±8 174±13 165±10 162±5 172±11 165±6 PLT(×109/L) 1,172±170 1,375±158a 1,285±132 1,293±381 1,157±165 1,254±95 1,279±140 1,389±189 WBC(×109/L) 9.08±3.23 6.19±1.39a 13.83±2.17 8.62±2.04b 9.00±2.50 10.35±2.87 13.71±4.30 15.04±3.93

2.4 临床生化分析

在A组实验中，与对照组动物同性别动物相比较，观察组雌雄性动物白蛋白（Albumin，ALB）、总蛋白（Total Protein，TP）均降低，雌性动物血糖（Blood Glucose，GLU）、血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）升高，雄性动物碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）、丙氨酸转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、甘油三酯（Triglyceride，TG）降低，肌酐（Creatinine，Cre）和BUN升高。在B组实验中，与对照组动物同性别动物相比较，观察组雌性动物Glu升高，雄性动物TP升高。A、B两组实验中其他临床生化指标无统计学意义的差异（P>0.05）。见表3。

表3.临床生化数据(n=10,±s)

表3.临床生化数据(n=10,±s)

注1：天冬氨酸转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST），总胆固醇（Total Cholesterol，TCHO），总胆红素（Total Bilirubin，TBil）注2：与同一时期对照组同性别动物相比，aP<0.05，表示统计学上有显著差异，bP<0.01，表示有极显著差异；无标记即为P>0.05，表示无统计学差异

指标 雌性 雄性 雌性 雄性对照组A 观察组A 对照组A 观察组A 对照组B 观察组B 对照组B 观察组B 35±3 32±2a 29±1 27±1b 37.0±1.4 35.4±2.1 31.1±0.7 31.4±1.3 36±6 44±12 77±15 63±12a 43.7±14.7 51.7±15.6 85.2±14.7 84.0±7.5 32±15 35±11 33±5 27±5a 51.7±9.3 59.0±39.8 69.7±17.9 65.2±8.9 130±45 148±57 123±25 129±21 153±28 130±28 210±58 206±44 2.10±0.48 2.17±0.28 1.52±0.29 1.54±0.20 2.28±0.38 2.20±0.42 1.48±0.25 1.55±0.23 42±6 52±20 36±6 55±10b 61.2±10.6 70.4±13.8 61.7±4.9 58.9±5.5 8.67±0.73 10.67±1.95a 9.16±1.00 10.64±3.01 7.38±0.89 8.37±0.85a 8.84±1.56 9.08±1.71 2.07±0.25 2.02±0.24 1.99±0.32 2.24±0.36 0.35±0.15 0.29±0.10 0.23±0.08 0.27±0.09 58±5 51±3b 51±3 45±2b 56.1±2.8 53.4±3.1 47.9±1.8 50.8±3.2a 0.69±0.28 0.79±0.25 1.10±0.30 0.77±0.23a 0.72±0.43 0.67±0.20 0.81±0.12 0.71±0.15 7.59±0.96 9.48±0.92b 6.44±0.87 7.70±1.56a 8.86±1.23 10.58±2.36 8.63±1.63 8.88±1.20 ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) TCHO(mmol/L)Cre(µmol/L) Glu(mmol/L) TBil(µmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)

2.5 大体剖检及脏器重量和系数

大体剖检中，实验的所有大鼠均未见明显损伤或病变。解剖时及时记录脏器湿重。经统计学分析，A组实验中，观察组雌性动物心脏重量及系数较对照组雌性动物减小；观察组雄性动物肝脏重量及系数、脑系数较对照组雄性动物减小，差异具有统计学意义。B组实验中，观察组雌性动物心脏、肝脏脏器重量较对照组减小，脑系数增大；观察组雄性动物心脏、脾脏、肾、肾上腺和脑系数增大，差异具有统计学意义。A、B两组实验中其他脏器重量、脏器系数无统计学意义的差异（P>0.05）。见表4、表5。

表4.各组大鼠脏器重量统计数据(n=10,±s,g)

表4.各组大鼠脏器重量统计数据(n=10,±s,g)

注：与同一时期对照组同性别动物相比，aP<0.05，表示统计学上有显著差异，bP<0.01，表示有极显著差异；无标记即为P>0.05，表示无统计学差异

脏器 雌性 雄性 雌性 雄性对照组A 观察组A 对照组A 观察组A 对照组B 观察组B 对照组B 观察组B心 1.065±0.150 0.917±0.071a 1.831±0.090 1.746±0.120 1.011±0.070 0.926±0.081a 1.606±0.116 1.541±0.153肝 8.199±1.247 7.700±0.486 14.532±1.138 12.357±0.961b 8.150±0.874 7.294±0.247a 13.566±0.908 12.394±1.517脾0.533±0.060 0.486±0.044 0.889±0.079 0.868±0.134 0.539±0.061 0.537±0.102 0.888±0.079 0.911±0.130肾1.765±0.219 1.720±0.139 3.058±0.233 3.161±0.190 1.817±0.214 1.768±0.101 3.077±0.210 3.083±0.304肾上腺 0.060±0.010 0.059±0.008 0.060±0.008 0.059±0.010 0.062±0.008 0.053±0.011 0.061±0.008 0.063±0.010胸腺 0.447±0.050 0.404±0.081 0.520±0.158 0.474±0.143 0.416±0.093 0.392±0.087 0.535±0.116 0.448±0.133脑1.934±0.080 1.948±0.085 2.119±0.099 2.132±0.060 2.003±0.147 1.982±0.096 2.205±0.128 2.157±0.082子宫 0.773±0.173 0.771±0.178 3.901±0.308 3.838±0.277 0.692±0.142 0.849±0.640 3.680±0.386 3.642±0.392卵巢 0.142±0.034 0.147±0.025 1.446±0.134 1.452±0.138 0.129±0.034 0.114±0.014 1.417±0.151 1.340±0.132

表5.各组大鼠脏器系数统计数据(n=10,±s,%)

表5.各组大鼠脏器系数统计数据(n=10,±s,%)

注：与同一时期对照组同性别动物相比，aP<0.05，表示统计学上有显著差异，bP<0.01，表示有极显著差异；无标记即为P>0.05，表示无统计学差异

脏器 雌性 雄性 雌性 雄性对照组A 观察组A 对照组A 观察组A 对照组B 观察组B 对照组B 观察组B心0.350±0.040 0.302±0.024b 0.307±0.016 0.308±0.016 0.305±0.020 0.307±0.025 0.255±0.014 0.274±0.019a肝2.697±0.332 2.541±0.280 2.432±0.124 2.176±0.112b 2.463±0.268 2.417±0.087 2.157±0.122 2.204±0.188脾 0.175±0.014 0.161±0.023 0.149±0.015 0.153±0.020 0.162±0.014 0.177±0.029 0.141±0.012 0.162±0.015b肾 0.580±0.050 0.566±0.047 0.513±0.045 0.557±0.031a 0.549±0.058 0.586±0.027 0.490±0.038 0.551±0.064a肾上腺 0.020±0.003 0.020±0.003 0.010±0.001 0.010±0.001 0.019±0.002 0.017±0.004 0.010±0.001 0.011±0.001a胸腺 0.148±0.023 0.133±0.029 0.087±0.026 0.083±0.024 0.126±0.029 0.130±0.025 0.085±0.018 0.071±0.029脑 0.639±0.036 0.643±0.063 0.355±0.018 0.376±0.023a 0.606±0.052 0.657±0.043a 0.351±0.028 0.387±0.041a子宫 0.254±0.048 0.255±0.066 0.655±0.065 0.678±0.062 0.210±0.046 0.280±0.206 0.586±0.067 0.652±0.092卵巢 0.047±0.013 0.048±0.007 0.242±0.023 0.256±0.028 0.039±0.010 0.038±0.005 0.226±0.030 0.241±0.036

2.6 组织病理

对所有大鼠的主要脏器进行组织病理学观察，主要见脾脏含铁血黄素沉积，偶见肝内肉芽肿，在对照组与观察组大鼠均可见，认为与实验样品无关。见图2、图3。

图2.肝脏，肉芽肿

图3.脾脏，含铁血黄素沉积

3.讨论

本次实验采用同样的染毒方式与染毒周期，比较不同浓度下银离子泡沫敷料亚慢性全身毒性试验差异。研究结果表明，当浸提比例为0.4g/mL时，从实验中期开始直至实验结束，观察组大鼠体重增长速度均小于对照组同性别大鼠，同一时期对照组大鼠体重明显大于观察组同性别大鼠，差异显著，并且随着时间推移，差异呈逐渐增大趋势。这种现象在雌雄性大鼠中均出现。观察组动物心脏、肝脏重量较对照组小，但仅雌性动物间的差异具有统计学意义。血液学和临床生化指标与对照组相比较未发现明显的异常。综上，认为在0.4g/mL的浸提比例下，银离子敷料明显影响观察组大鼠体重增长。当浸提比例为0.1g/mL时，观察组雌性动物体重与对照组同性别动物比较，未见有统计学意义的差异。仅观察组雄性动物在实验第84天和第90天时与对照组雄性动物相比体重较低，差异有统计学意义，观察组动物心脏、肝脏重量较对照组小，但仅雄性动物间的差异具有统计学意义。血液学和临床生化指标与对照组相比较未发现明显的异常。综合分析，在0.1g/mL的浸提比例下，银离子敷料未引起明显的亚慢性全身毒性，或在该实验的实验终点前，银离子引起的全身毒性不明显。

研究表明，银离子浓度在10ppm时杀菌作用较强，且对体外细胞存活率无任何影响，在浓度为12.5～25ppm时，银离子的细胞毒性增加非常明显[4]。银离子抗菌敷料在发挥杀菌特性的同时，也会产生一些不良反应。银的不良反应包括致敏、皮肤染色、含银敷料干扰医疗成像以及银中毒。本研究通过对银离子敷料的不同浸提比例浸提液进行亚慢性全身毒性研究，通过比较发现，低浓度的浸提液未引起动物明显的异常反应，或仅在实验接近终点时，对雄性动物体重增长有一定的影响。高浓度的浸提液能够更快表现出对动物体重增长产生抑制作用，具有一定的毒性，符合银离子浓度增加，细胞毒性增强的特点。然而，高浓度的浸提液远远超过实际临床使用剂量，尽管能够表明银离子在一定浓度下对人体会造成危害，但生物学评价的目的并非证明一种物质或器械在极大的、超乎实际的接触剂量下的危害作用，而是为临床安全使用器械提供依据和保障[5]。合理的使用器械，把使用器械带来的不良影响降到可接受范围内，发挥器械临床使用最大效益才是医疗器械生物学安全性评价的最终目的。因此，对医疗器械做生物安全性评价实验时，要把握好实验样品的浸提比例和浸提时间，在合理的实验条件范围内对器械做安全评估，对产品临床长期使用可能带来的不良反应做出预测，规避风险，使高效有用的器械被采用，在安全合理的使用条件下更好地服务患者。

在本次研究中，仅在动物体重变化这一观察指标体现出明显差异，其他临床检测指标和组织病理学并未见明显异常。有研究表明，在完整的皮肤表面使用银离子敷料，在汗水和皮脂的作用下，银离子会渗透皮肤进入体内，最终经肝肾代谢，也可经毛发和指甲生长代谢。在大鼠的开放性创面模型Ag标记的硝酸银溶液应用治疗研究中发现肝脏存在显著的银同位素吸收，而肾脏中存在较低水平[6]。在关于银离子的全身毒性试验中，可以增加动物摄食量和饮水量的检测，以及动物血液、尿液中银离子浓度的含量检测[7,8]。条件允许时，可以采用同位素标记的方法，了解银离子在动物身体中的全身吸收情况，为全身毒性研究提供更全面直接的依据。