贵州省2013-2021年羊种布鲁氏菌分离株的多位点可变数目串联重复序列分析

王 月，谭勤琴,2，刘 英，杨幸贵,2，营 夏,2，马 青，韦小瑜，李世军

布鲁氏菌(Brucella)是一类胞内寄生的革兰阴性菌，主要引起人兽共患性布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)[1-2]。FAO/WHO依据布鲁氏菌属细菌的生化特性及宿主偏好性将其分为6个经典种，19个生物型。羊种、牛种和猪种布鲁氏菌是人类感染布病的主要病原体[1]，贵州省布病疫情主要由羊种导致[3]。布鲁氏菌病原体可通过体表粘膜、消化道、呼吸道侵入机体，而人感染布病的途径通常与职业、饮食、生活习惯相关[1]。自2010年，“千万只肉羊”工程在贵州省启动，及后续“十二五规划”提出的“着力打造一批规模化、标准化、产业化的优质肉猪、肉羊、肉牛及地方特色畜禽生产基地，努力建设生态畜牧业大省”，使得我省养羊业获得长足发展[4]。贵州省于2010年首次从贵州省山羊血液分离到羊种布鲁氏菌[5]，到2015年，贵州省布病疫情已覆盖贵阳、 黔南、黔东南、铜仁、遵义、黔西南、六盘水、安顺和毕节9个市/州及贵安新区，仅部分县未报道过布病疫情[6]，防控形势严峻。

布鲁氏菌种间同源性高[7]，表型分析无法对其进行关联性研究，多位点可变数目串联重复序列分析(Multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)技术可克服这方面的缺陷，其分型数据可在MLVA数据库进行网络数据共享和分型鉴定，具有分辨率佳、重复性好、可比性高的特点[8-10]。MLVA分型技术基于非感染性核酸材料[11]，降低操作人员的感染风险，被广泛用于分子流行病学调查及溯源分析[12-14]。本研究采用MLVA-16方法对贵州省78株羊种布鲁氏菌本地株进行分子分型分析，以期发现贵州省羊种布鲁氏菌间的关联性，为贵州省布病疫情的科学防控提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 贵州省疾病预防控制中心布病实验室分离、鉴定及保存的羊种布鲁氏菌菌株(2013-2021年)，总计78株。

1.2 主要仪器与试剂 主要仪器有PCR扩增仪(美国Thermo)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad)等。主要试剂有布鲁氏菌琼脂培养基(美国BD)、引物及配套PCR试剂(北京天一辉远生物科技有限公司)。

1.3 细菌培养及DNA提取 将实验室保存菌株严格按照《2019布鲁氏菌病诊断标准(WS269-2019)》的操作程序接种于布鲁氏菌琼脂平板上，置37 ℃ CO2培养箱，根据细菌的生长情况培养24～48 h。挑取布鲁氏菌菌落研磨制成菌悬液，经煮沸法提取菌株核酸[3]，同时提取疫苗株M5、A19、S2的核酸作试验用阳性对照。

1.4 布鲁氏菌的复判 用布鲁氏菌属特异性基因BCSP-31[15]对菌株进行鉴定，疫苗株M5、A19及S2 核酸作阳性对照，纯水为阴性对照。依据文献[16]使用的B4和B5引物序列及扩增参数进行扩增，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 布鲁氏菌株种型的复判 采用基于布鲁氏菌属特异性插入序列IS711[17]建立的多重PCR技术对78株分离菌进行种/型鉴定[18]，疫苗株M5、A19及S2核酸作阳性对照，纯水作阴性对照。依据文献[19]使用的引物序列和扩增参数进行扩增，产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 布鲁氏菌株MLVA-16分型 78株布鲁氏菌株根据文献[20]使用的16个位点引物及扩增参数扩增。MLVA-16包括panel 1、panel 2A和panel 2B，共16个位点，MLVA-8即panel 1的所有8个位点，用于布鲁氏菌种的分析。Panel 1(06、08、11、12、42、43、45及55 )各位点的扩增产物在实验室内进行琼脂凝胶电泳，挑取差异序列送北京天一辉远生物科技有限公司进行测序。对测得序列进行整理，去除侧翼序列得到该位点的串联重复序列，通过换算，得到该序列的重复串联数值。Panel 2包括 panel 2A(18、 19、21)和panel 2B(04、07、09、16、30)，各位点采用FAM基团标记引物进行扩增，产物送公司进行毛细管电泳，结果参照Panel 2各位点重复单元长度及重复数目换算表得到重复数值。

1.7 MLVA基因型分析 将MLVA基因型数值输入MLVAbank(http//mcrobes genotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)数据库进行比对确定其MLVA-8的基因型。用 BioNumerics (Version 8.0)软件对78株羊种菌分离株MLVA基因型进行聚类分析，聚类方式用非加权组平均法 (UPGMA)，构建聚类分析树状图和最小生成树(Minimum spanning tree，MST)。

2 结 果

2.1 BCSP31-PCR的复判结果 除阴性对照外，78株菌株核酸及疫苗株核酸的的扩增产物均产生分子量约为223 bp的条带，判为布鲁氏菌属细菌。

2.2 AMOS-PCR对布鲁氏菌种/型的复判结果 78株本地分离株和M5的扩增产物均出现分子量约为731 bp和178 bp的条带，鉴定为羊种布鲁氏菌，阴性对照无特异条带出现。

2.3 MLVA-8分型结果 78株羊种布鲁氏菌基于MLVA-8分型被分为5种型(即42、43、45、58和1种未分类型)，以42、43型为主，二者占总数91.03%，见表1。42型在全省7个市/州均有分布，分布最广。黔西南地区分布着4种MLVA-8基因型，多样性较高，且出现一种新基因型(1-5-3-12-3-1-3-2)，见表2。

表1 78株羊种布鲁氏菌的MLVA-8 基因型别及百分比Tab.1 MLVA-8 genotypes and percentages of 78 B. melitensis strains

表2 78株羊种布鲁氏菌MLVA-8基因型的地区分布Tab.2 Regional distribution of MLVA-8 genotypes of the 78 B. melitensis strains

2.4 MLVA-16分型结果 78株羊种布鲁氏菌基于MLVA-16分型数据构建聚类分析树状图，分为4个群，46种MLVA-16基因型，单基因型分离株32株，余46株构成14种MLVA-16基因型(图1)。 MLVA-16基因型的地区分布中，遵义市16种，黔东南州11种，该2地为贵州省MLVA-16基因型多样性主要聚集地(表3)。78株羊种菌基于MLVA-16分型数据并以每个节点相同位点最大距离为1构建MST，78株分离株被分为8个遗传复合体和14个单体，遵义与黔东南、黔南及毕节地区的菌株间均存在共享基因型，同一地区年份相近的菌株基因型之间的遗传距离也很近(图2)。

图1 贵州省78株羊种布鲁氏菌的MLVA-16聚类分析树状图Fig.1 Dendrogram based on MLVA genotyping analysis (UPGMA method), showing the correlations among 78 B. melitensis strains

表3 78株羊种布鲁氏菌MLVA-16基因型的地区分布Tab.3 Regional distribution of MLVA-16 genotypes of the 78 B. melitensis strains

图2 贵州省78株羊种布鲁氏菌MLVA基因型聚类分析的MST图Fig.2 Clustering analysis MST (minimum spanning tree) mapping based on MLVA genotype data for 78 B. melitensis strains

3 讨 论

贵州省布病疫情的扩大蔓延，是由于近年来贵州省养羊业迅猛发展，大量从省外引种[21]，加之养殖模式大多为散养和小规模养殖，散养户对布病的认知及防治知识匮乏，自我保护技能欠缺，导致疫情形势严峻[6]。

羊种布鲁氏菌是贵州省布病疫情的主要病原体，本研究对2013-2021年间贵州省78株羊种菌进行MLVA基因分型，基于MLVA-8分型数据分为5种基因型(即42、43、45、58和1种未分类型)。42及43型占总数91.03%，属省内羊种布鲁氏菌优势基因型，国内研究者研究证明该2种基因型也是国内布鲁氏菌的优势基因型[22-28]，证实贵州省羊种布鲁氏菌流行株与国内流行株一致。贵州省羊种布鲁氏菌已鉴定的MLVA-8基因型均属于“东地中海型”，即其地理起源可能相同。黔西南地区布鲁氏菌的分离株存在4种MLVA-8基因型，基因型多样性较高，鉴于MLVA-16的panel 1模块位点的变异度较低，提示该地可能存在多个布鲁氏菌传染源。黔南及黔西南邻近云南及广西2省，广西、云南均鉴定出布鲁氏菌58型[26,28]，在山西、青海均有布鲁氏菌45型的分布[26-27]，基因型的一致性提示疫情病原菌间存在一定关联性，可能为与邻省间的畜牧贸易活动相关，故应加强畜牧贸易活动的监管，同时严格执行动物的检验检疫。未明确分类的MLVA-8型(1-5-3-12-3-1-3-2)分离于2016年，此后未再检出该基因型，提示布鲁氏菌可能为适应不同的自然地理环境而改变了其基因型[29]。

基于MLVA-16分型数据，78株羊种菌分离株聚为4个基因群(A-D)，分为46种基因型，亲缘关系较近(≥73.9)，单基因型菌株32株,余46株构成14种共享基因型，证实贵州省羊种布鲁氏菌分离株MLVA基因型具有型别多样性。MLVA-16基因型的地区分布中，遵义及黔东南州分布的基因型最多，提示这2地的布病疫情可能存在多个传染源。MST图显示，相邻时间段，相邻地区流行的基因型遗传距离较近，提示贵州省省内布病疫情流行株的基因型未发生较大改变，遵义与黔南、黔东南、毕节等地的布鲁氏菌流行株间的共享基因型，从时间维度(遵义疫情早于其他地区疫情)及基因型角度，揭示布病疫情可能存在从遵义扩散导致的省内传播。2015年之后，贵州南部(黔东南、黔南、黔西南)相继出现聚集性布病疫情，其基因型与遵义疫情基因型间的遗传距离较远，而与临省广西、云南的MLVA-8基因型一致，提示可能为省外输入性导致的聚集性布病疫情。

布鲁氏菌的MLVA分型分析对于布病疫情判断及防控具有重要意义，贵州省羊种布鲁氏菌分离株经MLVA分析发现，贵州省布病疫情可能存在以遵义为中心的省内传播及来自省外输入传播的多条传播链。相关部门需要做好布病疫情的外防输入，内防扩散，卫生疾控部门与动物防疫部门应加强联防联控，对于外防输入，须严格加强对跨地区动物检疫，对于内防扩散，加强疫情监测是相关部门需要关注的防控重点。

利益冲突：无