布鲁氏菌病新型疫苗研究进展

刘晨芳, 翟景波, 梁 晨, 德恩金, 张国庆, 王立军, 梁秀文

布鲁氏菌病(简称布病)是一个世界范围内重大公共卫生问题，是由布鲁氏菌属侵入机体，引起的传染-变态反应性的人兽共患传染病，在8种最容易被忽视的人兽共患疾病中排名第3[1]，同时也是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病。布鲁氏菌主要通过破损的皮肤黏膜、消化道和呼吸道等途径传播，人类患病后主要表现为发热、多汗、乏力、关节疼痛等多样化症状，且容易迁延累及多个系统成为慢性虚弱性疾病，动物患病后主要表现为流产、睾丸炎、附睾炎。

布鲁氏菌病的流行为人类、动物健康及畜牧业发展带来极大威胁及经济损失，作为一种传染性疾病，控制布病疫情流行最有效的手段之一是接种疫苗。目前尚无被批准用于人类的布病疫苗[2]，人与受感染的家畜接触往往是最常见的患病途径，因此，控制布鲁氏菌病等人兽共患疾病需要“同一健康”的理念，人类布鲁氏菌病可以通过控制或根除动物布鲁氏菌病的途径得到最大程度的控制[3]。自20世纪初人们就开始了关于预防人和动物布病的疫苗研究[4]，目前使用最为广泛的布病疫苗为减毒活疫苗，如国外广泛使用的B.abortusS19、B．melitensisRev1疫苗及我国的B．suisS2、B.abortusA19、B．melitensisM5疫苗[5-6]，这些疫苗在控制布鲁氏菌病方面是具有很大成效，但存在干扰诊断试验、对人类具有致病性、可能导致怀孕动物流产等缺点[2]，因此研制有效而安全的布鲁氏菌病疫苗一直是科学家面临的一项挑战。

按照研发技术来分，疫苗可分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，其成分一般包含整个病原体。近年来，随着分子微生物学、基因工程等生物技术的发展，研发与减毒活疫苗具有同等或更高保护效力的新型布病疫苗成为热点，这些疫苗主要包括重组蛋白疫苗、核酸疫苗(DNA疫苗和RNA疫苗)、基因缺失疫苗、病毒样颗粒疫苗、载体疫苗等，这些疫苗的免疫原性及保护水平主要在小鼠模型中评估(表1)。

1 重组蛋白疫苗

重组蛋白疫苗是将病原体的目的抗原基因构建在表达载体上，将已构建的表达蛋白载体转化到细菌、酵母或哺乳动物或昆虫细胞中，进行大量培养，在一定的诱导条件下，表达出大量的抗原蛋白，通过纯化后制备成疫苗。重组蛋白疫苗的优点在于安全性高，不需要分离获得菌株，再培养细菌来进行制造，只需要通过生物工程技术表达、纯化布鲁氏菌的抗原蛋白，不会引起疫苗生产者的感染及周围环境的污染。目前已有许多关于布鲁氏菌重组蛋白疫苗的相关研究，这些疫苗的免疫原性及保护力也被证实具有一定效果。重组蛋白疫苗研发的关键在于选择合适的抗原。目前已经发现的布鲁氏菌相关蛋白有上千种，其中与布鲁氏菌毒力及免疫原性密切相关的有外膜蛋白(OMPs)，Ⅳ型分泌系统相关蛋白，还有胞质蛋白，尤其是外膜蛋白，因为它们是最早与宿主接触的成分，因而成为布鲁氏菌疫苗重要的候选抗原[7]。目前研究比较多的蛋白为Omp31、Omp28、Omp25、Omp19、Omp16、核糖体蛋白 L7/L12、IV 型分泌系统相关的蛋白 Vir B12 和胞质结合蛋白 P39等。

有研究表明选取多个抗原表位的疫苗比单一抗原可能会诱导更高水平的免疫保护，通常仅由一种抗原组成的疫苗不能有效地预防布鲁氏菌感染。Yahya等[8]构建了rOmp25-Omp31重组蛋白疫苗，在BALB/c小鼠体内诱导了较高水平的IFN-γ和TNF-α，结果提示该疫苗免疫后小鼠产生了较强的Th1型免疫应答倾向；Gupta等[9]构建了Omp25和L7/L12的双价重组疫苗，并对单独和联合使用的疫苗潜力进行了评估，结果表明免疫双价疫苗的小鼠表现出比单个基因疫苗更好的保护作用，发现2价疫苗具有针对其组分rOmp25和rL7/L12的高IgG水平的免疫原性，可以在小鼠体内诱发Th2介导的免疫反应，从而针对布鲁氏菌的感染提供保护力。Tran等[10]在RAW 264.7细胞系和鼠模型中，评估了4种布鲁氏菌蛋白(Omp16、Omp19、Omp28、L7/L12)作为组合的重组蛋白疫苗的免疫原性及保护力，该疫苗处理的RAW 264.7细胞可显著诱导IFN-γ和IL-12的产生，同时降低IL-10的产生，在处理的细胞中，一氧化氮产生的增强以及细胞因子分泌模式证明该疫苗显著激活了巨噬细胞中的杀菌机制，与PBS对照组相比，用重组疫苗免疫的小鼠诱导高水平的TNF-α、IL-6和MCP-1的细胞因子的产生，主要诱导Th1型免疫反应，是一个潜在的预防布鲁氏菌病的候选疫苗。除了布鲁氏菌自身的免疫相关蛋白抗原以外，有研究者采用细胞因子与布鲁氏菌外膜蛋白进行融合[11]，获得重组蛋白，以增加小鼠感染布鲁氏菌后的保护性免疫，研究者对其二级结构和抗原性进行了计算机水平的预测，表明这种嵌合蛋白可用作小鼠模型中针对布鲁氏菌感染的候选亚单位疫苗，但仍需临床前实验进行抗原性和保护力的进一步评估。目前大多数重组蛋白疫苗仍需加入佐剂以增强疫苗的免疫原性及保护力。亚单位候选疫苗的构建和评估是通过实验技术进行的，如免疫反应性抗原的克隆和表达、体外和体内免疫原性评估，这些实验方法耗时较长且步骤繁琐，经常会有失败的可能性，因此，基于3D结构的计算建模、B细胞和T细胞表位的预测以及MHC结合效力等免疫信息学的先进算法和处理工具被用于疫苗开发[12]。相关研究表明，与单组分亚单位疫苗相比，多组分疫苗能够诱导更多的保护性免疫反应[13]。Mahdiye等[14]利用免疫信息学策略，利用布鲁氏菌抗原Omp31、BP26、BLS、DnaK和L7-L12的免疫优势表位，设计了一种针对布鲁氏菌病的保护性多表位疫苗，并通过电子方法评估了构建疫苗的免疫学和理化特性，免疫信息学分析表明，这种多表位肽疫苗可以有效表达，并有可能用于布鲁氏菌病的预防或治疗，这种通过信息学进行表位预测及免疫特性评估的方式有望提供一种更安全、特异性较强、节约成本的布鲁氏菌新型亚单位疫苗构建方法。

2 DNA疫苗

DNA疫苗概念的诞生，最初是在1990年Wolff等[15]将DNA重组表达载体注入小鼠骨骼肌中，发现该DNA能够在肌细胞中表达、并产生抗体，即最初的DNA疫苗。布鲁氏菌DNA疫苗是指将编码某种布鲁氏菌抗原蛋白的DNA片段，通过适合的载体导入动物体内，并通过宿主细胞的表达系统合成相应的抗原蛋白，从而诱导宿主产生针对布鲁氏菌的免疫应答，以达到预防布鲁氏菌感染的目的。与重组蛋白疫苗不同，DNA疫苗在制备方法上要更加便捷，不需要在体外进行蛋白的表达及纯化，因此成为布鲁氏菌新型疫苗研究领域的热点。

Moslem等[16]将布鲁氏菌omp25和omp31基因克隆到真核表达载体 pcDNA3.1/Hygro (+) 中，结果表明DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后，可引发明显的IgG应答、T细胞增殖应答和诱导较高水平的IFN-γ分泌，表明该疫苗能产生以Th1型为主的T细胞免疫应答，能在杀灭和清除体内布鲁氏菌的过程中起到重要的作用。Emilia等[17]设计了铜锌超氧化物歧化酶和布鲁氏菌基因组岛-3(bab1_0260、bab1_0270、bab1_0273和bab1_0278)的开放阅读框的多表位DNA质粒疫苗嵌合体，结果表明该DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生典型的以Th1为主的免疫应答，激发了IgG2a和IFN-γ的产生。另外，开发布鲁氏菌病DNA疫苗的潜在候选抗原还包括gntR[18]、omp2b[19]、L7/L12[20]、bvrR[21]、bls[22]等。布鲁氏菌DNA疫苗适合于诱导保护性免疫和针对布鲁氏菌等胞内病原体制定有效、安全的免疫策略，一些研究表明，与相应的单价疫苗相比，多价疫苗联合免疫能诱导更强的免疫应答，并对布鲁氏菌的入侵有更好的保护作用[21]。目前已有文献报道的布鲁氏菌DNA疫苗均在一定程度上能有效地诱导动物产生较强的体液和细胞免疫应答，并在攻毒实验中能降低布鲁氏菌的细菌载量，但保护程度仍不能达到减毒活疫苗的免疫效果，考虑到DNA疫苗具有安全性高、生产便捷、设计灵活等优点，仍需要探索新的疫苗设计策略来提升布鲁氏菌DNA疫苗的免疫原性。

3 基因标记疫苗

基因缺失疫苗是通过基因工程技术使疫苗株中某些特定毒力基因缺失，从而减弱病原体毒力、同时因特定基因的缺失可以与野毒株感染进行鉴别区分[23]，通过这种方式改造的新疫苗既保留有较强的免疫原性，同时安全性更高，并解决了疫苗免疫和野毒株感染造成的血清学检测混淆的难题，具有重要的研究价值。由新疆畜牧科学院兽医所和天康生物联合研发的A19-ΔVirB12为基因缺失疫苗，在原A19疫苗株的基础上敲除布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统中毒力基因virB12，该疫苗已在犊牛中进行了安全性、有效性的评估[24]，同时证实该疫苗可以针对疫苗免疫和野毒株感染进行有效区分，且通过多抗原检测可以提高A19-ΔVirB12免疫和田间感染鉴别诊断的准确性[25]，有助于免疫净化，目前该疫苗已获得农业农村部颁发的新兽药证书，表明布鲁氏菌病疫苗研究领域取得了新的突破。冯生等[26]以omp16(BMEI0340)基因为研究靶点，利用基因同源重组技术构建了A19-ΔOmp16 缺失突变株，且可稳定遗传，毒力较A19有一定程度减弱，通过omp16抗体的检测结果可以区分疫苗免疫及野毒株的感染；彭小薇等[27]以牛种布鲁氏菌 2308为亲本株，构建了牛种布鲁氏菌clpP基因缺失疫苗，评估了该疫苗在 RAW264.7 巨噬细胞感染模型和小鼠感染模型中的毒力及免疫保护力，结果表明基因标记疫苗毒力显著低于布鲁氏菌 2308株，表明clpP基因与布鲁氏菌毒力相关，但经攻毒保护实验证实该疫苗保护力明显降低，可能原因为无法诱导机体产生足够的细胞免疫反应。

4 载体疫苗

载体疫苗是指将编码目的抗原的基因通过分子生物学手段导入减毒的细菌或病毒中，从而借助细菌或病毒使目的基因进入宿主并得以正确表达，诱发相应的免疫保护应答[28]。因载体本身在进入宿主体内时即可启动免疫反应，因此载体疫苗在一定程度上可以增强疫苗的免疫原性。开发安全有效的布鲁氏菌病疫苗，最重要的策略之一是使用能产生布鲁氏菌抗原的非致病微生物(细菌和病毒)载体。目前乳酸乳球菌[29]、大肠杆菌[30]、肠道沙门氏菌[31]已被用作体内表达布鲁氏菌病蛋白抗原的载体。成璐[32]构建了重组质粒 pMV306-L7/L12-Omp16，并导入牛分枝杆菌卡介苗(BCG)感受态细胞中，构建了布鲁氏菌BCG载体疫苗，结果表明该载体疫苗可以诱导机体细胞免疫反应的显著增强。周丽丽等[33]将减毒沙门菌作为载体，递送布鲁氏菌bls-L7/L12融合基因重组真核质粒，观察其诱导细胞免疫、体液免疫及粘膜免疫应答的能力，结果提示该疫苗可以诱发机体产生以 Th1为主的免疫反应。相关研究表明纳米尺寸的抗原会增强抗原免疫原性，此外纳米疫苗可以承载多种抗原，提供抗原靶向性及稳定性。郑晗旭[34]采用水热法制备了酚醛树脂磁性复合微球 Fe3O4@CFR 纳米粒子，将纯化后的P39和Rsα蛋白与被酚醛树脂修饰后的 Fe3O4磁性材料纳米粒子吸附，免疫小鼠后结果表明该纳米颗粒疫苗纳米粒子可以促进抗原在体内的递呈，提高抗体水平，但是不同蛋白是有差异的，可以在一定程度上促进IgG2a的分泌，可能影响Th1型免疫，但具体机制有待进一步探索，此研究结果可为布鲁氏菌病纳米疫苗的研制提供依据。

5 菌影疫苗

细菌菌影(bacterial ghosts，BGs)是通过生物灭活的方式在革兰氏阴性菌细胞膜上形成裂解孔道，使得核酸和其他胞质内容物通过孔道排出，形成细菌空壳，由于细菌细胞膜保留完整，BGs具有固有的免疫原性，目前已被用于疫苗递送系统和疫苗佐剂[35]。研究表明通过基因工程手段制备的BGs保留了病原菌的几乎所有结构抗原[36]，包括病原体相关分子模式 (PAMPs)，例如脂多糖 (LPS)、脂蛋白 (LPP)、肽聚糖 (PGN) 和菌毛等[37]，可诱导非常强、有效的体液免疫和细胞免疫反应。 Wang等[38]构建了布鲁氏菌2308ΔGntR菌影疫苗， 其中攻毒实验结果表明，免疫后的BALB/c小鼠产生了抗S2308攻击的高保护性免疫，同时诱导小鼠产生了抗布鲁氏菌特异性IgG，并诱导细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌，此外该菌影疫苗表现出较强的脾脏CD4+和CD8+T细胞反应，这些结果表明该疫苗是一种潜在的布鲁氏菌新型候选疫苗。在疫苗的设计研究中，佐剂是重要的组成部分，菌影本身因表面具有 LPS、鞭毛等结构而具有很强的佐剂活性，同时也能够通过鞭毛、菌毛等粘附分子携带其他佐剂进入体内，从而加强免疫效果[39]。

表1 布鲁氏菌病新型疫苗特点及代表性疫苗研究Tab.1 Characteristics of novel brucellosis vaccines and representative vaccine studies

6 总结与展望

自20世纪初就有关于预防人和动物布病的疫苗研究[40]。虽然体液免疫反应对于预防布鲁氏菌病很重要，但针对布鲁氏菌的免疫保护主要取决于细胞免疫，特别是巨噬细胞和T细胞，已被证明是抵御布鲁氏菌和其他细胞内细菌病原体的关键[41]。到目前为止，针对布鲁氏菌入侵最有效的保护力是由激发强大细胞介导免疫的减毒活疫苗提供的[42]。因此，开发新的有效的布鲁氏菌病疫苗的关键在于诱导显著的Th1免疫应答并提供高水平的保护效果[43]。新型布病疫苗在一定程度上克服了传统疫苗安全性不高、免疫期短及制备程序复杂的缺点，但仍未有明确的新型疫苗被推广应用，主要原因为新型疫苗提供的保护力仍未达到理想水平，且目前大部分布病疫苗研究都是在小鼠、家兔等动物中进行，这可能与在大型动物中进行疫苗的评价实验的成本过高有关。然而更为重要的是需要设计开发能够增强新型疫苗免疫原性的新策略，仍需进一步阐明布鲁氏菌的致病机制，同时在抗原的选取、动物模型的选择以及有效的佐剂及递送载体等方面进行深入探索，此外生物信息学、反向疫苗学等技术的应用有助于识别保护性抗原中最有可能引发免疫反应的区域，对于疫苗免疫原性的预测及提高具有重要的意义。

利益冲突：无