模式识别受体在病毒性出血热中作用的研究进展

石红妍，郑煦暘，张 颖

病毒性出血热(viral hemorrhagic fevers，VHFs)是一类以发热、出血、凝血功能障碍、低血压休克等为特征的急性传染病。可引起人类 VHFs 的病毒包括沙粒病毒科病毒(如拉沙病毒)、丝状病毒科病毒[如埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)和马尔堡病毒]、布尼亚病毒目病毒[如汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)、发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)]、黄病毒科病毒[黄热病毒和登革病毒(Dengue virus，DENV)]，披膜病毒科病毒[如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)]等。近年来，由于全球气候变暖、贸易往来增强、人口流动性增加等因素，导致上述病毒流行地域扩大、患病人群增加，严重威胁全球公共卫生安全。

病毒入侵时，固有免疫系统反应迅速，并在激活适应性免疫系统中发挥关键作用。模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)是执行固有免疫功能的重要分子，可分为膜结合型和细胞质结合型，前者包括Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)和C型凝集素受体，后者包括维甲酸诱导基因1样受体(RIG-I-like receptors，RLRs)、核苷酸寡聚结构域样受体(nucleotide oligomerization domain-like receptors，NLRs)和环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)等。在病毒感染过程中，单核巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)和自然杀伤细胞等固有免疫细胞以及其他组织细胞(如上皮细胞)表达的PRRs均能识别病毒具有的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)(如病毒核酸、蛋白等)，激活多条免疫信号通路，诱导促炎细胞因子和干扰素(Interferon，IFN)的产生，从而引发抗病毒免疫反应[1]。因此，模式识别受体作为固有免疫反应的起始环节，在抗VHFs免疫反应中必将发挥重要作用。同时，某些病毒蛋白与宿主固有免疫分子相互作用，影响宿主的免疫功能，并与病毒免疫逃逸有关。以下将以受体类型为序，介绍其在VHFs中的最新研究进展。

1 TLRs

TLRs是一类膜蛋白，其特征是胞外区含有不同数量的富含亮氨酸重复序列，并由胞内结构域发挥信号转导功能。TLRs是重要的PRRs，可识别表达于病原微生物的脂磷壁酸、双链RNA、脂多糖、鞭毛蛋白、非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序等，通过髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等信号分子启动胞内信号转导通路，激活相关炎性细胞因子和IFN-I 的基因表达，诱导有效的免疫反应。TLRs可分为几个亚家族，每个亚家族都识别相关的PAMPs。

1.1 TLRs在登革病毒感染中的作用 George等[2]在小鼠模型研究发现急性DENV感染可通过TLR2/MyD88途径诱导CD4+Foxp3+Treg增殖。Lai等[3]研究发现DENV感染DC后，线粒体DNA释放到胞浆中，导致TLR9激活及其下游的MAPK p38和NF-κB信号转导，可能促进DC迁移和IFN的产生，从而限制病毒的复制。Chao[4]、Quirino-Teixeira等[5]已报道DENV非结构蛋白1(nonstructural protein1，NS1)可通过TLR4-MyD88途径诱导血小板活化，这可能是DENV感染期间血小板减少和出血的原因之一。Martinez-Moreno等[6]发现健康受试者连续10 d口服维生素D(4 000 IU/d)后，使用DENV-2刺激单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived DCs，MDDCs)，结果MDDCs上TLR3、TLR7和TLR9的表达减少，白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)和白细胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)水平下降，白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)表达增加，MDDCs对DENV-2感染的敏感性降低。Parthasarathy等[7]对DENV感染的角膜中TLR表达的分析显示，感染后TLR4、TLR7、TLR9和TLR10上调，可能导致角膜中促炎反应加剧。在最近一项关于DENV和CHIKV混合感染的研究中，Sengupta等[8]发现TLR7、TLR8受体基因多态性与机体对DENV的易感性有关。

1.2 TLRs在汉坦病毒感染中的作用 Zhang等[9]研究发现，汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)感染人脐静脉内皮细胞可激活TLR3、RIG-I和MDA5信号通路，并通过下游NF-κB和干扰素调节因子-7(Interferon regulating factor-7, IRF-7)直接与CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)的启动子结合，导致CXCL10表达增加，并且CXCL10的升高与肾综合征出血热的严重程度呈正相关。Jiang等[10]研究发现，HTNV包膜糖蛋白(Gn和/或Gc)可能是激活TLR4的成分。HTNV 感染EVC304细胞后，TLR4 转录水平上调，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IFN-β 分泌增多。其机制是 TLR4 通过 MyD88 非依赖性信号转导通路介导转录因子NF-κB和干扰素调节因子-3(Interferon regulating factor-3, IRF-3)的细胞核移位，诱导上述细胞因子的表达。

1.3 TLRs在其他出血热病毒感染中的作用 Ayithan等[11]研究发现埃博拉病毒样颗粒(Ebola virus-like particles，eVLP)通过TLR3和TLR4途径的MyD88和含Toll样/白细胞介素-1受体(TIR)结构域的β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)两条信号通路来触发宿主免疫反应，诱导一系列有效的抗病毒干扰素刺激基因(Interferon stimulated gene，ISG)和IFN产生。Lai等[12]研究发现高纯度的重组EBOV囊膜蛋白GP能有效地被巨噬细胞内化，通过TLR4途径诱导IL-6，白细胞介素-2，白细胞介素-5，白细胞介素-4, 单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，TNF-α，白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，IFN-γ，IL-12等细胞因子的产生，同时促进免疫细胞向引流淋巴结的迁移，并可能促进体内CD4+T细胞的激活和增殖。Li等[13]发现SFTSV感染通过TLR8-MyD88轴触发NF-κB通路。Song等[14]通过对70例急性SFTSV感染者血清动态变化综合分析得出，单核细胞与髓系树突状细胞TLR3表达的抑制与疾病严重程度密切相关。回顾性研究发现，TLR7、8、9和10的基因多态性与土耳其CCHF患者的病情严重程度和预后相关[15-18]。

2 RLRs

RLRs是一类重要的模式识别受体，介导IFN-I和其他基因的转录，激活抗病毒固有免疫反应。近期研究表明，病毒和宿主来源的RNA都可以激活RLRs，引起有效的抗病毒反应，但如果RLRs活性不受控制，将导致免疫病理损伤。在识别病毒RNA序列后，RLRs类模式识别受体RIG-I和MDA5 N端半胱氨酸天冬氨酸酶激活招募结构域与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)相互作用，激活IRF3和IRF7，进而与NF-κB一起，诱导IFN-I和促炎细胞因子的产生。

2.1 RLRs在登革病毒感染中的作用 SIRTs是一类脱乙酰酶家族蛋白，通过调节免疫相关基因转录，在控制炎症中发挥重要作用。Li等[19]在HEK293T细胞进行SIRT6基因干扰和过表达，结果发现SIRT6通过RLR和TLR3信号通路负向调节DENV诱导的炎症反应，其机制是SIRT6核心区与NF-κB p65的DNA结合域相互作用，与p65竞争占据IL-6启动子。Kamaladasa等[20]将既往严重登革热(severe dengue，SD)或既往非严重登革热(non-severe dengue，NSD)的健康人的单核细胞与自体血清孵育后，感染全部4种DENV血清型。36 h后结果显示，与感染非免疫DENV血清型的NSD患者相比，经历过SD的个体显示RIG-I、IFN-β1和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3)基因显著上调。

2.2 RLRs在汉坦病毒及其他出血热病毒感染中的作用 Ma等[21]研究表明HTNV感染通过RIG-I-IRF7途径激活了长链非编码RNA核旁斑组装转录物1(lncRNA NEAT1)的转录，而NEAT1通过解除富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子蛋白的转录抑制作用促进了RIG-I和DExD/H盒解螺旋酶60的表达。Kell等[22]研究发现紫外线灭活病毒在体外未能诱导ISG表达，而单独的HTNV核酸片段(S、M和L)的体外转录 RNA在转染细胞时可激活抗病毒转录反应。因此，病毒基因转录或复制过程中未被包被的RNA可能作为RLRs识别的PAMPs，在抗HTNV固有免疫过程中发挥作用。He等[23]研究发现EBOV的病毒蛋白24(viral protein24, VP24)能有效地抑制依赖RIG-I和MDA5的I型和III型IFN启动子的激活。Min等[24]研究表明SFTSV可以通过RLR-MAVS信号途径(尤其是RIG-I-MAVS)感知病毒感染产生的PAMPs(主要是5’-三磷酸化的RNA)，诱导I型IFN、ISG和炎症细胞因子的表达，引起免疫和炎症反应，限制病毒复制。然而，在RIG-I激活阶段，RLR介导的抗病毒信号可以被SFTSV的NSs所拮抗。

3 NLRs

NLRs参与炎症小体蛋白质复合体的组装，是机体固有免疫反应的重要组成部分。NLRs由保守的NAIP、CIITA、HET-E、NACHT和多达3个其他特征结构域组成(包括LRR、CARD、PYD或BIR结构域)。目前已在人类发现了23个NLR基因。部分NLRs(包括NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2)通常介导含胱天蛋白酶-1前体(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1)的激活而协助清除病原体。其中NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白以及pro-caspase-1组成。该炎症小体激活后进行组装，促进pro-caspase-1的自我裂解，产生活性亚基p20，引起IL-1β和IL-18的成熟和分泌。

3.1 NLRs在登革病毒感染中的作用 Pan等[25-26]发现DENV感染促进IL-1β释放，导致小鼠组织血管内皮通透性增加和血管渗漏，其机制为DENV M蛋白与NLRP3相互作用，促进NLRP3炎症小体的组装和激活，从而诱导促炎细胞因子的释放。Shrivastava等[27]发现DENV-2感染诱导血管内皮细胞HMEC-1中NLRP3炎症小体的激活，他们还在HMEC-1中过表达DENV的NS2A、NS2B蛋白，发现其可促进NLRP3炎症体复合体的组装，并通过钙动员或破坏线粒体电位和诱导活性氧的产生而导致caspase-1激活和IL-1β的分泌。Khan等[28]将纯化的DENV-2包膜蛋白结构域III(envelope protein III region，EIII)与分化的THP-1细胞共培养，检测到上清液和细胞中IL-1β水平增加。其机制为NLRP3炎症小体的激活和NF-κB的核转位。Lien等研究发现：1)DENV和EIII在体外诱导内皮细胞焦亡，NLRP3炎症小体抑制剂处理后减轻。与野生型小鼠相比，顺序注射EIII和DENV的NS1自身抗体的NLRP3炎症小体级缺陷小鼠的病理生理变化明显减轻[29]。 2)DENV和EIII作用于小鼠血小板后，可诱导NLRP3依赖的血小板细胞死亡和血小板减少[30]。3)DENV的EIII可在体内外诱导NLRP3依赖的中性粒细胞外诱捕网形成，促进炎症反应[31]。

3.2 NLRs在汉坦病毒及其他出血热病毒感染中的作用 Ye等[32]研究表明汉坦病毒可诱导THP-1细胞中NLRP3型炎症小体的形成，这可能是肾综合征出血热患者IL-1β水平升高的原因之一。Halfmann等[33]研究发现EBOV感染导致NLRP3炎症小体的激活，随后分泌IL-1β和IL-18。这一过程依赖于NLRP3炎症小体复合体的一个组成部分caspase-1，但不依赖于病毒复制。Li等[13]研究发现SFTSV感染诱导依赖BAK/BAX的线粒体DNA释放触发NLRP3炎症小体激活，发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)患者全血样本BAK表达水平与疾病进展和死亡结局相关。Liu等[34]发现SFTSV感染人PBMC、巨噬细胞和C57/BL6小鼠均可激活NLRP3分泌IL-1β。Li等[35]发现SFTS患者血清中IL-1β显著升高，与病毒载量呈负相关，进一步在体外用SFTSV感染健康人PBMCs，发现NLRP3型炎症小体激活导致IL-1β和IL-18分泌增加。

4 结语与展望

从前期研究发现，目前研究出血热病毒模式识别受体相关内容的研究模式主要有：分子表达与临床表现或临床指标的相关性研究、体外病毒感染(感染动物或培养细胞)与免疫机制研究、病毒蛋白/核酸等成分与PRRs体外相互作用研究、PRRs基因多态性研究等。在各种出血热病毒感染中NLRP3的研究最为广泛，其原因可能是该分子发现时间较久，抗体引物等各类研究工具较为成熟。其余PRRs在不同出血热中的研究结果差异可能是由于病毒种类、核酸及蛋白结构的不同，但可能也与研究所用的细胞/动物及进行研究的PRRs种类选择有关。表1中总结了目前模式识别受体在VHFs中的部分重要研究信息。

表1 模式识别受体在病毒性出血热中的研究Tab.1 Research of pattern recognition receptors in viral hemorrhagic fever

目前多数有关VHFs中PRRs作用的研究仍有待进一步完善，在未来的研究中，可能采取的改进优化思路有：1)构建更加全面反映相关疾病主要病变(如发热、血管渗漏、凝血功能紊乱等)的动物模型，在此基础上进行有关PRRs功能缺失研究(如基因敲除、表达干扰等)，从而明确在感染发病中起关键作用的PRRs。2)在基于临床样本的研究中，更多的采用基因芯片、单细胞测序等技术，较为全面的了解各类PRRs及其下游信号分子在临床病程中的变化，避免因研究对象选择而产生结果的偏向性。3)更多聚焦病毒与机体PRRs相互作用的具体结构成分(如某种蛋白结构域或核酸片段等)及后续信号转导过程，深入探索不同病毒间关键成分差异对其与PRRs相互作用的影响。另外值得注意的是，TLR基因为代表的部分PRRs的遗传变异或基因多态性可能使机体产生对同一病原体的不同先天免疫反应，从而影响感染个体的疾病易感性和临床结局，将PRRs基因多态性对其分子结构和功能的影响与临床表现差异相联系，也是一个可能的研究方向。

利益冲突：无