CFH基因多态性与玻璃体液VEGF对年龄相关性黄斑变性患者抗VEGF疗效影响的交互作用△

赵 文 赵 斐 李 敏 叶慧芳

年龄相关性黄斑变性(AMD)是继青光眼、白内障后眼科常见的第三大类致盲性疾病，慢性进行性是AMD病情进展的重要特点，因此，及时有效治疗意义重大[1]。雷珠单抗能通过抗血管内皮生长因子(VEGF)机制，防治AMD造成的视力损害，但并非所有AMD患者均能视力获益，加之玻璃体内注射雷珠单抗为侵入性，且费用昂贵，存在眼内炎、外伤性白内障等并发症风险，故掌握AMD抗VEGF治疗无应答机制，明确其危险因素，对精准筛查抗VEGF治疗适宜人群至关重要[2]。补体因子H(CFH)基因定位于染色体1q32上，当前已证实CFH基因多态性与AMD易感性相关，是AMD的一个重要遗传学机制，但是否会影响抗VEGF应答性尚未完全明确[3]。黄斑区脉络膜新生血管是AMD主要病理特征之一，VEGF具有促血管新生作用，参与AMD发病与病情进展[4]。基于此，本研究尝试探讨CFH基因多态性与玻璃体液VEGF对AMD抗VEGF疗效影响的交互作用，期待为抗VEGF治疗应答结果异质性的阐明、合理使用抗VEGF药物等提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020年5月～2022年1月广州医科大学附属第三医院眼科149例(149眼)AMD患者为研究对象。纳入标准：(1)符合AMD诊断标准[5]，AMD分型为湿性；(2)既往无相关治疗史；(3)单侧发病；(4)自愿签署知情同意书。排除标准：(1)既往有眼部手术史者；(2)青光眼、葡萄膜炎；(3)视网膜脱离；(4)高度近视、遗传性疾病等其他原因造成的黄斑区脉络膜新生血管；(5)出现瘢痕化的AMD患者；(6)严重的心脑血管疾病者。全组患者均自愿签署知情同意书，本研究获本院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法与分组所有患者均给予雷珠单抗(Novartis Pharma Schweiz AG，批准文号S20181010)0.5 mg玻璃体内注射，治疗周期为3个月，之后根据病情需要进行注射。所有患者均完成3次注射。根据抗VEGF治疗是否有应答，分为应答组(111例111眼)、无应答组(38例38眼)。应答组：治疗后3个月，视力提高≥5个ETDRS字母数；无应答组：视力改善<5个ETDRS字母数。无应答组患者年龄、体重指数、性别比例、眼别、视网膜积液、椭圆体带完整性、眼压、最佳矫正视力与应答组比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。

表1 两组患者一般资料比较

1.2.2 主要试剂与仪器PCR仪(75002型，美国ABI公司)；分光光度计(AA-200型，美国PE公司)；DNA提取试剂盒(山东博科生物)；PCR反应试剂盒(美国Axygen公司)；酶标仪(国产彩虹GF-M3000型)；VEGF试剂盒(上海初态生物)。

1.2.3 检测CFH基因多态性检测方法：就诊时采集5 mL肝素抗凝空腹静脉血，DNA提取试剂盒提取DNA，分光光度计检测纯度，通过Sanger双脱氧终止测序法检测CFH位点rs800292、rs1061170、rs529825、rs1410996位点的基因型，以基因DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系包括Taq DNA聚合酶、引物、4种dNTP、靶序列DNA和PCR反应缓冲液。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃低温复性30 s，72 ℃退火延伸1 min，扩增40个循环。

1.2.4 检测玻璃体液VEGF三通道玻璃体切割法采集玻璃体液标本0.5 mL，将玻璃体切割头切割端断开，此断开口通过一个针头连接一无菌带盖密封的玻璃瓶，另一个针头通过无菌盖连接原玻璃体切割导管断开位置，接机器端，此时即可按常规方法切割玻璃体，可控地收集玻璃体液。采集后患者若有眼部出血，需根据出血量多少酌情处理，出血量较少时，保守治疗，避免剧烈运动，半卧位休息，出血量较多时，给予促进出血吸收的药物。所有患者术中与术后均无并发症发生。应用酶标仪和双抗体夹心酶联免疫吸附法检测玻璃体液VEGF水平，读取450 nm波长下的光密度值，绘制标准曲线，查出对应VEGF浓度。

1.3 观察指标(1)比较两组患者CFH位点rs800292、rs1061170、rs529825、rs1410996位点基因型分布；(2)比较两组患者玻璃体液VEGF水平；(3)比较玻璃体液VEGF不同水平患者CFH基因多态性；(4)分析抗VEGF疗效的影响因素；(5)分析CFH基因多态性与玻璃体液VEGF对抗VEGF疗效影响的交互作用。

2 结果

2.1 两组患者CFH基因多态性比较无应答组患者CFH位点rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布与应答组比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；无应答组患者CFH位点rs1061170基因型分布与应答组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者CFH基因多态性比较

2.2 两组患者玻璃体液VEGF比较全部患者玻璃体液VEGF为(632.37±189.03)×10-9g·L-1，根据VEGF水平分组，VEGF高水平患者42例，低水平患者107例。无应答组患者玻璃体液VEGF为(843.26±151.85)×10-9g·L-1，高于应答组(560.17±129.34)×10-9g·L-1，(t=11.128，P=0.000)。

2.3 玻璃体液VEGF不同水平患者CFH基因多态性比较玻璃体液VEGF高水平患者与低水平患者CFH位点rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；玻璃体液VEGF高水平患者CFH位点rs1061170基因型分布与低水平患者比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 玻璃体液VEGF不同水平患者CFH基因多态性比较

2.4 抗VEGF疗效的影响因素分析以抗VEGF治疗是否有应答为因变量(有=0，无=1)进行单因素和多因素Logistic回归分析，结果显示，在全部AMD患者中，玻璃体液VEGF、CFH位点rs1061170 CC基因型均是抗VEGF疗效的独立相关影响因素(均为P<0.05)；CFH位点rs1061170 TC基因型与抗VEGF疗效无关(P>0.05)(表4)。

表4 抗VEGF疗效的影响因素分析

2.5 CFH基因多态性与患者玻璃体液VEGF对抗VEGF疗效影响的交互作用分析在全部AMD患者中，单独玻璃体液VEGF的OR值为41.250，单独rs1061170基因型CC的OR值为22.000，两者共存时的OR值为759.000，且γ为1.068，提示患者玻璃体液VEGF升高与CFH位点rs1061170 CC基因型在抗VEGF疗效中呈正向交互作用；同时交互作用<两单独因素OR值的乘积，则患者玻璃体液VEGF升高与CFH位点rs1061170 CC基因型交互作用符合次相乘模型(表5)。

表5 CFH基因多态性与患者玻璃体液VEGF对抗VEGF疗效影响的交互作用分析

3 讨论

抗VEGF已成为现阶段AMD的一线治疗药物，多项随机临床试验亦证实抗VEGF治疗的有效性、可靠性，但仍存在部分患者在接受昂贵治疗后获益较小或无获益，表现出对抗VEGF治疗无应答，所以有必要对此进行深入研究[6]。

先天免疫系统中，补体系统能通过凝集素、旁路、经典途径矫正自身组织、防御入侵病原体，其中涉及多个相互关联的分子级联途径[7]。补体C3作为补体系统中含量最多、最重要的成分，是凝集素和经典途径的汇合点，也是旁路途径激活的关键因子，在补体激活途径中处于枢纽位置[8]。C3可在C3转化酶作用下，分解为C3a、C3b，其中C3a能结合自身受体刺激胶原蛋白在黄斑区视网膜色素上皮的沉积，在AMD发病早期起到重要作用；C3b过度沉积可激活补体旁路途径，造成AMD病情进一步进展[9-10]。CFH一方面能抑制C3转化酶形成，加速C3转化酶衰变，另一方面CFH对C3b具有较高亲和力，可竞争性结合C3b，促进C3b的裂解，保护宿主细胞免受攻击和损伤，从而防止C3a、C3b介导的AMD及其病情的进展[11-12]。

本研究结果表明，无应答组患者CFH位点rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布与应答组相似(均为P>0.05)，无应答组患者CFH位点rs1061170基因型分布与应答组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示CFH位点rs800292、rs529825、rs1410996与AMD抗VEGF治疗应答无关，CFH位点rs1061170可能与AMD抗VEGF应答有关。为了揭示两者关系，本研究进一步进行了Logistic回归分析，结果表明，CFH位点rs1061170 CC基因型是抗VEGF疗效的独立相关影响因素。Blánquez-Martínez等[13]报道纳入了高度近视伴脉络膜新生血管患者，发现CFH位点rs1061170 TT基因型患者较CC基因型患者有更好的治疗效果。Medina等[14]对AMD患者注射抗VEGF药物后，发现CC基因型患者治疗后最佳矫正视力低于TT+TC基因型，与本研究结论相似。CFH位点rs1061170多态性位于第9外显子的1277位置上，T碱基突变为C可使CFH第402位酪氨酸变为组胺酸，减弱旁路途径活性，降低对C3a、C3b的转化作用，造成补体系统过度激活、脉络膜血管内皮损伤，以及新生血管持续形成，故会影响抗VEGF治疗反应性[15-16]。

VEGF可作用于视网膜，使视网膜长出新生血管[17]。有研究[18]发现，AMD患者外周循环中VEGF高于健康人群，且其表达水平与患者视力丧失密切相关。尽管目前关于AMD患者VEGF表达水平的研究较多，但致力于研究VEGF与治疗应答性关系的报道较少。本研究结果表明，与应答组比较，无应答组患者玻璃体液VEGF升高，是AMD抗VEGF疗效的独立影响因素。VEGF不仅能促进血管内皮细胞分裂、增殖，还能增加血管壁通透性[19]。高水平VEGF可介导大量新生血管，增加治疗难度，并能通过调节血管壁通透性，引起黄斑区炎症反应，损伤血管内皮细胞，形成恶性循环，从而影响抗VEGF疗效[20]。本研究结果表明，患者玻璃体液VEGF升高与CFH位点rs1061170 CC基因型在抗VEGF疗效中呈正向交互作用，且交互作用符合次相乘模型，提示CFH基因多态性与玻璃体液VEGF共存时，可进一步降低患者对抗VEGF治疗的应答。对VEGF高水平患者，或可通过增加抗VEGF药物剂量、次数等保证疗效，但对CFH位点rs1061170 CC基因型患者，经抗VEGF治疗后获益的可能性较小，尤其是当患者玻璃体液VEGF水平较高时，应酌情考虑选取其他治疗方法，以保证治疗方案的有效性，并减少盲目应用抗VEGF药物增加患者经济负担及潜在的并发症风险。另外，本研究因诊断需要，在患者充分知情前提下，采集眼局部玻璃体液VEGF，虽然保证能可靠地反映患者新生血管的生成潜能与病情进展可能性，但为侵入性操作，其临床推广应用情况受到患者接受度的影响，这是本研究一个局限之处，下一步需改进标本采集方法，以增加其临床大范围应用的可能性。

综上所述，患者玻璃体液VEGF升高与CFH位点rs1061170 CC基因型在AMD抗VEGF疗效中呈正向交互作用，且交互作用符合次相乘模型，这能为临床抗VEGF药物精准使用提供参考，一方面能保证治疗方案的有效性，另一方面能减少盲目应用抗VEGF药物增加患者经济负担及潜在的并发症风险。