糖尿病视网膜病变患者广域荧光造影结果与血常规白细胞系指标的相关性

黄黎黎 李乐乐 王 敏 朱 妍 张冬梅 宋 愈

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最严重的眼部并发症之一，是成年人失明的主要原因。根据疾病不同的发展阶段所表现的不同眼底特征和病理变化将DR分为两类，即非增生型DR(NPDR)和增生型DR(PDR)。区分不同时期DR的主要工具是荧光素眼底血管造影(FFA)。它不仅可以在动态下观察视网膜微血管功能，还能清晰显示异常增生的新生血管和纤维组织，以此来评价视网膜病变的严重程度[1-3]。但是，传统的血管造影只能显示大约50°的后极部视网膜，不能全面反映视网膜情况。目前，广域荧光造影(UWFA)越来越多地用于周边视网膜的检查[4]。我们在对部分眼底病变患者进行UWFA检查时发现，周边视网膜中存在范围更大的无灌注区、微血管异常和新生血管，其中大多数与DR病变有关[4-6]。在UWFA检查时，我们依据眼底图像特征对DR患者的眼底进行了重新分级和分析，以更全面地了解DR进展。

DR是全身炎症的一种表现，而慢性炎症可促使糖尿病患者微血管和大血管发生病变，并加速疾病进展[7]。外周血中有五种白细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)在一定程度上可以反映炎症反应和免疫反应之间的动态平衡[8]。既往研究显示，中性粒细胞、NLR与DR的特征性表现有一定的关系[9-10]。但是，基于DR患者的UWFA不同图像特点与白细胞系指标的相关性研究尚未见报道。因此，本研究旨在探讨UWFA下DR的不同表现与血常规白细胞系指标之间的相关性，以期进一步认识DR与全身炎症标志物之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2016年1月至2019年3月在南通大学第二附属医院就诊的2型糖尿病患者的临床资料。纳入标准：(1)临床诊断为2型糖尿病[11]；(2)住院期间血液学指标[糖化血红蛋白(HbA1c)、血常规、凝血功能、肝肾功能等]完整；(3)住院期间完成UWFA检查并被诊断为DR；(4)无眼部手术或激光治疗史。排除标准：(1)屈光间质混浊(角膜病变、白内障、玻璃体积血等)，不能有效观察血管造影图像结果，从而影响图像分类和分级；(2)眼部治疗史，包括视网膜激光光凝、玻璃体内注射、白内障摘除术等；(3)既往和新发葡萄膜炎；(4)血管造影显示合并其他原因引起的视网膜病变；(5)因药物或身体其他器官炎症性病变导致血常规明显异常。

1.2 数据收集收集患者基本特征信息，筛选符合入组条件的研究对象。所有患者均行UWFA检查，并于UWFA检查前1周内完成外周血中HbA1c、血常规等指标检查，完成眼部和全身情况检查。血常规主要包括白细胞系、红细胞系及血小板系相关指标的检查。

1.3 UWFA检查排除检查禁忌证，所有患者通过肘前静脉注射3 mL 200 g·L-1荧光素钠，并使用海德堡Spectralis超广角镜(102°)拍摄眼底图像。由2名具有10年以上眼底造影诊断经验的医师，分别对所有患眼的静脉期UWFA图像进行分析。将两位医师的分析结果进行比较，并对具有不同判断结果的图像交由第三位医师进行重新评估，以获得最终结果。

微血管渗漏选择静脉期及其之后的晚期造影图像分析。在静脉期分析无灌注区、新生血管、纤维增殖膜，以免晚期荧光素渗漏后影响无灌注区测量。其中，(1) 微血管荧光渗漏：视网膜任何部位无渗漏的患者为0级，其余患者根据荧光素渗漏象限数分为1～4级。以视盘为中心十字划分,将眼底分为四个象限,分别为鼻上、鼻下、颞上和颞下象限。荧光素渗漏出现在几个象限就即为几级。(2) 毛细血管无灌注区：使用海德堡眼底照相机的图像测量工具进行检测。张惠蓉[12]研究发现，当视网膜的无灌注区面积超过7视盘面积或有新生血管时，是激光光凝治疗的指征。因此，我们选择无灌注区面积7视盘面积为分级标准，无灌注区面积<7视盘面积者为0级，无灌注区面积≥7视盘面积者为1级。(3) 新生血管：根据“高危PDR”概念，对新生血管进行分级。0级为无新生血管；1级为

图1 52岁女性糖尿病病程10年的2型糖尿病患者的眼底检查图 A：海德堡Spectralis超广角镜(102°)静脉期眼底造影图像。各象限视网膜均有微血管渗漏，记为4级。使用图像系统描记工具手工画出视网膜无灌注区(黄线区域)，>7视盘面积，记为1级。新生血管面积明显大于1/2视盘面积，记为2级。未见纤维增殖膜，记为0级。B： 海德堡55°镜头下静脉期FFA。周边视网膜观察受到限制。C：该患者眼底照片，可见新生血管和出血。

1.4 统计学处理采用SPSS 23.0统计软件分析各类数据。外周血指标与UWFA图像特征进行Spearman相关分析。运用Logistics回归分析法对影响PDR的因素进行分析。单因素分析中P<0.1的变量，再进行多因素分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 患者基本特征本研究共纳入115例患者的199眼，其中，男62例、女53例，右眼102眼、左眼97眼，年龄31～76(56.7±8.9)岁，糖尿病病程平均10年(0～30年)。54例患者有高血压病史。199眼中81眼为PDR， 118眼为NPDR，其中轻度NPDR 15眼，中度NPDR 10眼，重度NPDR 93眼。患者血液学指标见表1。

表1 纳入研究的患者血液学指标 (n=115)

2.2 UWFA检查UWFA检查结果显示，154眼(77.39%)有4级微血管荧光渗漏，9眼(4.52%)有3级微血管荧光渗漏，4眼(2.01%)有2级微血管荧光渗漏，13眼(6.53%)有1级微血管荧光渗漏，19眼(9.55%)有0级微血管荧光渗漏。105眼(52.76%)为0级毛细血管无灌注，94眼(47.23%)为1级毛细血管无灌注。118眼(59.30%)为0级新生血管，42眼(21.11%)为1级新生血管，39眼(19.60%)为2级新生血管。183眼(91.96%)为0级纤维增殖膜，16眼(8.04%)为1级纤维增殖膜。

2.3 相关性分析微血管渗漏与NLR、中性粒细胞比率、单核细胞比率均相关(均为P<0.05)，与白细胞数、淋巴细胞比率、嗜碱性粒细胞比率、嗜酸性粒细胞比率均无相关性(均为P>0.05)。毛细血管无灌注与单核细胞比率、嗜酸性粒细胞比率均相关(均为P<0.05)，与白细胞数、中性粒细胞比率、淋巴细胞比率、嗜碱性粒细胞比率、NLR均无相关性(均为P>0.05)。新生血管与单核细胞比率相关(P=0.038),与白细胞数、中性粒细胞比率、淋巴细胞比率、嗜碱性粒细胞比率、嗜酸性粒细胞比率、NLR均无相关性(均为P>0.05)。纤维增殖膜与单核细胞比率相关(P=0.002),与白细胞数、中性粒细胞比率、淋巴细胞比率、嗜碱性粒细胞比率、嗜酸性粒细胞比率、NLR均无相关性(均为P>0.05)(表2)。

表2 外周血白细胞系指标与UWFA图像特征的相关性

2.4 影响PDR的因素单因素分析结果显示，单核细胞比率(P=0.032)和嗜酸性粒细胞比率(P=0.040)可进入多因素分析。多因素分析结果显示，只有嗜酸性粒细胞比率与PDR独立相关(OR=1.250，95%CI:1.039～1.505，P=0.018)(表3)。

表3 PDR的影响因素

3 讨论

本研究回顾性分析DR患者的UWFA图像特征，更广泛、更深入地观察视网膜微血管病变，以期进一步了解疾病进展过程。我们对每个图像特征进行分级，并与外周血白细胞系进行统计学分析。结果表明，DR患者的UWFA不同病变图像特征与白细胞系指标相关。研究结果进一步证实了DR的炎症损伤机制，为我们从全血白细胞水平探索DR不同阶段微血管病变的发生发展提供了一些启示。

相当一部分DR患者眼底病变涉及到周边视网膜，对周围视网膜进行更广泛的观察对于疾病的筛查、诊断、治疗和预后非常重要[14]。然而，传统的血管造影只能在单个视图中显示30°～50°范围的视网膜。对于DR患者，UWFA能展现比传统眼底血管造影更好的周边视网膜视图，可显示与DR相关的外周血管渗漏的造影图像[15]。视网膜动脉和静脉中造影剂的晚期渗漏，反映了活动性视网膜病变中血-视网膜屏障(BRB)的破坏。本研究使用UWFA获得更大范围的周边视网膜图像，可以对DR患者的视网膜改变有更全面的了解。本研究UWFA造影静脉期和晚期微血管渗漏情况，同样提示了BRB的损害。张惠蓉[12]认为，当视网膜的无灌注区面积≥7视盘面积或有新生血管时，应行激光光凝治疗，但文献并未提及眼底检查所用方法及是否显示了更周边的视网膜微血管病变。与普通造影相比，UWFA显示非灌注区面积增加3.9倍，新生血管面积增加1.9倍[16-17]。暂未见关于视网膜无灌注区严重程度的分级标准。因此，本研究借鉴张惠蓉[12]的研究，将7视盘面积作为UWFA图像中无灌注区面积分级的标准。随着视网膜无灌注区的逐渐扩大和长期缺氧，将导致新生血管产生和纤维增殖膜形成，进而导致DR进展。

在病理条件下，外周血中性粒细胞在组织迁移和激活后，可分泌细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和其他物质，导致组织损伤和免疫细胞浸润[18]。淋巴细胞可促进慢性炎症的发生，一些中性粒细胞的激活还可以抑制淋巴细胞产生[19]。在一定程度上，NLR可以反映炎症和免疫反应之间的动态平衡[9,11]。既往的研究表明，中性粒细胞增多可能影响视网膜色素上皮屏障的完整性[20]。在本研究中，UWFA图像中的微血管造影剂渗漏提示BRB破坏和血管内皮功能损害。血管内皮具有重要功能，包括调控微血管通透性、凝血、炎症、血管张力和新生血管[21]。糖尿病、高胆固醇血症和高血压导致血管内皮L-精氨酸/一氧化氮合酶的失调，并导致血管内皮功能障碍[22]。HbA1c与循环黏附分子(细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子等)水平升高密切相关，这些黏附分子被认为是内皮细胞损伤的指标，并与DR的严重程度相关[23]。本研究结果表明，微血管荧光渗漏与外周血白细胞系指标中NLR有关，与文献[23]结果一致。

受损的毛细血管内皮细胞使组织灌注和氧合减少，以及血管闭塞加重，最终导致无灌注。Schröder等[24]于1991年首次提出活化的白细胞导致毛细血管阻塞的概念，并证明粒细胞和单核细胞堆积在视网膜毛细血管中。与正常细胞相比，糖尿病患者的白细胞，尤其是毛细血管中的白细胞，释放更多的活性氧，损伤内皮细胞和周细胞，并通过氧化应激导致视网膜病变[25-26]。由晚期糖基化终末产物积累引起的炎症介质水平升高，也可导致视网膜持续慢性炎症，导致白细胞活化、血管内皮黏附及外渗[27-28]。此外有研究表明，正常范围内白细胞计数升高与糖尿病微血管和大血管并发症有关[29]。本研究结果显示，视网膜毛细血管无灌注与外周血单核细胞和嗜酸性粒细胞的比率有关。这些结果表明，视网膜从早期的血管内皮细胞损伤发展到晚期的毛细血管闭塞，外周血中嗜酸性粒细胞和单核细胞的比率可能反映了疾病的进程。

单核细胞是主要的白细胞亚型之一，也是炎症标志物[30]。相关动物研究表明，当许多单核细胞进入视网膜组织时，视网膜色素上皮充当单核细胞运输到视网膜的通道[31-32]。之前的研究表明，在DR患者中，调节单核细胞趋化和炎症过程的单核细胞趋化蛋白-1在血浆中含量显著升高[33]。外周血单核细胞水平与DR患病率之间也存在关联[34]。本研究结果显示，外周血单核细胞比率与视网膜新生血管和增殖纤维膜形成有关。此外有研究表明，单核细胞和巨噬细胞可能参与动脉粥样硬化的血管生成过程[35-36]。循环血液中的单核细胞被认为是巨噬细胞的前体，其主要功能是在炎症期转变为巨噬细胞。在组织损伤后，诱导炎症和巨噬细胞聚集，促进巨噬细胞原位增殖和血管内皮生长因子的合成。随后，它促进新血管的生长，并激活成纤维细胞产生胶原[37]。在DR进展过程中，慢性炎症会导致微血管损伤，而巨噬细胞参与这一过程。这一过程很好地解释了本研究的结果。

PDR是DR进展的最后阶段，最终导致患者失明[1-2]。在本研究中，只有嗜酸性粒细胞比率与PDR独立相关。研究显示，糖尿病涉及免疫失调和嗜酸性粒细胞改变[38]；在患有PDR的男性和女性患者中均观察到嗜酸性粒细胞计数升高[39]。PDR可能涉及嗜酸性粒细胞特异性趋化因子，这些趋化因子在DR相关的炎症中起重要作用[40]。

综上所述，在DR的UWFA中，微血管渗漏与NLR相关，毛细血管无灌注与单核细胞比率和嗜酸性粒细胞比率相关，新生血管与单核细胞比率相关，纤维增殖膜与单核细胞比率相关。因此，以上白细胞系相关指标对于深入了解DR患者视网膜微血管病变的演变过程具有一定的启发价值。此外，嗜酸性粒细胞比率与PDR的发生密切相关，可能需要进一步研究以确定其预测和诊断价值。