液相色谱-三重四极杆质谱法测定谷物中6种低毒杀菌剂的残留量

朱将伟,赵 燕,尹 君

(1.上海市浦东新区农产品质量安全中心,上海 201202; 2.上海市质量监督检验技术研究院,上海 200233)

使用杀菌剂是防治作物病害的一种经济有效的方法,但杀菌剂在土壤、水体以及农作物上的残留仍然存在较大隐患[1]。许多杀菌剂的抑菌谱呈广谱性,在杀灭病原微生物的同时也会抑制有益菌的生长,导致潜在的生态风险。另外,许多目前正广泛使用的杀菌剂虽然对人畜等哺乳动物毒性较低,但对于其他生物可能有较高的毒性,例如,苯醚甲环唑与戊唑醇属低毒杀菌剂,但它们对鱼类有较高的毒性,如果以残留有苯醚甲环唑或戊唑醇的谷物作为原材料制作鱼类饲料将会有较大的风险,因此对谷物或其他农产品中农用杀菌剂残留量进行全面监测就显得十分重要[2-3]。

目前,杀菌剂的检测方法种类繁多,主要可归纳为3大类:免疫检测法、色谱法、色谱-质谱联用法。免疫检测法灵敏度较高,但稳定性、重现性较差,多用于快速检测;色谱法应用广泛,但是当同时检测的化合物数量越多时,其对色谱分离的要求就越高,耗时也越久,另外,限于色谱上所连接的常规检测器的局限性,阳性结果通常需要再次确认;而色谱-质谱联用法灵敏度高、选择性强,检测结果无需再次确认[4]。

烯酰吗啉、嘧霉胺、苯醚甲环唑、丙环唑、咪鲜胺和戊唑醇等6种杀菌剂是目前在粮食作物生产中应用较为广泛的杀菌剂,其残留检出率也相对较高。而目前用于杀菌剂检测的国家标准(或行业标准)只能用于一种或者一类杀菌剂的测定,例如,GB 23200.49-2016《食品安全国家标准 食品中苯醚甲环唑残留量的测定 气相色谱-质谱法》仅用于食品中苯醚甲环唑残留量的测定,而GB 23200.54-2016《食品安全国家标准 食品中甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的测定 气相色谱-质谱法》只能用于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的测定。

针对上述问题,本工作用乙腈-二氯甲烷体系提取谷物样品中的残留杀菌剂,并经C18固相萃取柱净化,采用液相色谱-三重四极杆质谱法同时测定烯酰吗啉、嘧霉胺、苯醚甲环唑、丙环唑、咪鲜胺和戊唑醇等6种杀菌剂的残留量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260/6430型液相色谱-三重四极杆质谱联用仪;OA-SYS型24位氮吹仪(带控温);HY-4型可调速多用途振荡器;Supelclean LC-18 C18固相萃取柱(100 mg/3 mL),Oasis®HLB固 相 萃 取 柱(200 mg/6 mL),弗罗里硅土固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

混合标准溶液1:取适量的6种杀菌剂标准品,用甲醇溶解并配制成质量浓度均为5.00 mg·L-1的混合标准溶液1。同法配制质量浓度均为1.00 mg·L-1的混合标准溶液2。

杀菌剂烯酰吗啉、嘧霉胺、苯醚甲环唑、丙环唑、咪鲜胺、戊唑醇标准品的纯度均大于99.0%;乙腈、甲醇、二氯甲烷和甲酸均为色谱纯,其他试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Agilent C18色 谱 柱(100 mm×3.0 mm,1.8μL);柱温30℃;进样量3.0μL;流量0.3 mL·min-1;流动相A为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.5 min时,B为50%;0.5～6.0 min时,B由50%升至90%,保持2.0 min;8.0～11.0 min时,B由90%升至95%;11.0～13.0 min时,B由95%降至50%,保持2.0 min。

1.2.2 质谱条件

对于观察组，全身麻醉，患者取截石位行患侧输尿管逆行插入F6导管并留置导尿管。取俯卧位后。针对患者的腹部施以垫高处理，B超引导下完成目标肾盏穿刺操作，通过穿刺针鞘，置入J型导丝，将患者皮肤切开后，顺导丝针对患者的肾造瘘口展开扩张操作，完成后置入F18一次性可撕开鞘。鞘内置入F15 Wolf肾镜，对结石进行明确后开始钬激光碎石操作并取石，能量设置2.0 J，频率20 Hz。手术后输尿管内置入F7输尿管支架管，肾盂内留置F16造瘘管。

电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;干燥气温度325℃,干燥气流量10 L·min-1;雾化压力275.8 k Pa;采用多反应监测模式扫描;其他质谱参数见表1,软件自动选择响应高的子离子用于定量。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理

取1 000 g谷物样品,人工去除谷物中肉眼可见的杂质,粉碎、混匀后备用。

准确称取10 g已粉碎的谷物样品至250 mL窄口玻璃瓶中,加入100 mL乙腈,连续振荡30 min,将乙腈提取液过滤至100 mL浓缩瓶中,在40℃水浴中浓缩至约5 mL。取100 mL 4 g·L-1氯化钠溶液分3次溶解浓缩液,然后全部转移至分液漏斗中,再用50 mL二氯甲烷振荡提取10 min(重复1次)。有机相层经预先装有无水硫酸钠的漏斗过滤,滤液收集在浓缩瓶中,于40℃水浴中减压浓缩至近干,残渣用5 mL甲醇溶解,过C18固相萃取柱(C18固相萃取柱先用10 mL甲醇淋洗),用5 mL甲醇洗脱,将收集的全部洗脱液在氮吹仪下吹干[5-7],残余物用50%(体积分数,下同)乙腈溶液定容至1 mL,用0.2μm滤膜过滤后按照仪器工作条件测定。

1.3.2 定性分析

相关样品在相同的测定条件下进行分析时,若样品中检出色谱峰的保留时间与某种杀菌剂标准品的保留时间一致,而且在扣除背景后所选择的两对离子对及丰度比也一致,即可认为该样品中残留这种杀菌剂[8-9]。

1.3.3 定量分析

试验采用基质匹配的混合标准溶液系列进行测定,以减小基质对定量分析的影响,外标法定量。取5 mL经过柱洗脱的空白基质溶液5份,氮吹至0.5 mL以下,分别加入适量的混合标准溶液1和混合标准溶液2,用50%乙腈溶液定容,配制成质量浓度为1.00,10.00,50.00,100.00,1 000.0μg·L-1的基质匹配的混合标准溶液系列,现配现用。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

在杀菌剂残留分析中常以乙腈、乙腈-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇-丙酮等体系作为提取溶剂。试验比较了上述4组提取溶剂的提取效果。结果表明:以乙腈-二氯甲烷体系作为提取溶剂时,所得目标物的回收率均在90.0%左右,并且提取物中杂质比较少;使用其他3种提取溶剂时,所得目标物的回收率波动较大,提取物中的杂质也相对较多,会影响后续净化处理。因此,试验选择乙腈-二氯甲烷体系作为提取溶剂。

2.2 固相萃取柱的选择

2.3 流动相的选择

在前期试验中已经充分认识到在流动相(水相)中添加适量的甲酸和甲酸铵的必要性。甲酸能有效促进离子化,甲酸铵能改善峰形和调节离子化水平;甲酸的体积分数若高于0.1%时会提高基线噪声,并造成灵敏度下降,甲酸铵的浓度若高于3 mmol·L-1时对基线的稳定性也会产生负面影响。因此,流动相中水相选择含有0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液。

试验进一步比较了乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液、甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液两组流动相对目标物的分离效果。结果表明,采用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相时,其质谱响应值较甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相时高17%～30%,且峰形与色谱分离效果均较好。因此,试验最终选用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸铵溶液作为流动相。图1为6种杀菌剂的总离子流色谱图。

图1 总离子流色谱图Fig.1 Total ion chro matogra m

2.4 工作曲线和检出限

按照仪器工作条件测定基质匹配的混合标准溶液系列,以响应更高的子离子作为定量子离子,以各杀菌剂的定量子离子响应值对其相应质量浓度绘制工作曲线。结果表明,各杀菌剂的质量浓度在1.00～1 000.0μg·L-1内与其定量子离子响应值呈线性关系,其他线性参数见表2。当被测样品中杀菌剂质量浓度超出上述线性范围时,可进行稀释或浓缩处理后再测定。

按3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),结果见表2。

表2 线性参数与检出限Tab.2 Linearity par ameters and detection limits

2.5 精密度与回收试验、方法比对

对两组空白谷物样品进行加标回收试验,计算回收率及测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。同时,按照我国现行国家标准或行业标准(GB 23200.46-2016《食品安全国家标准 食品中嘧霉胺、嘧菌胺、腈菌唑、嘧菌酯残留量的测定 气相色谱-质谱法》用于测定嘧霉胺;GB 23200.49-2016用于测定苯醚甲环唑;SN/T 2917-2011《出口食品中烯酰吗啉残留量检测方法》用于测定烯酰吗啉;SN/T 0519-2010《进出口食品中丙环唑残留量的检测方法》用于测定丙环唑;NY/T 1456-2007《水果中咪鲜胺残留量的测定 气相色谱法》用于测定咪鲜胺;SN/T 1952-2007《进出口粮谷中戊唑醇残留量的检测方法 气相色谱-质谱法》用于测定戊唑醇)对这两组加标谷物样品中各杀菌剂的残留量进行测定,比对结果见表3。

表3 精密度与回收试验结果以及不同方法比对结果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery,and comparison results of different methods(n＝5)

结果表明:各杀菌剂的回收率为87.9%～96.5%,测定值的RSD为2.7%～6.8%;本法所得测定结果与标准方法所得结果基本相当(P＞0.05,无显著性差异)。说明方法准确度高、精密度好。

本工作将谷物样品中的残留杀菌剂先用乙腈-二氯甲烷体系进行提取,再经C18固相萃取柱净化,采用液相色谱-三重四极杆质谱法进行分析,能对谷物样品中的多种杀菌剂残留进行准确定性和定量检测,其灵敏度和准确度均较好。方法较GB 23200.46-2016、GB 23200.49-2016以 及SN/T 2917-2011等标准方法更为简便,耗时也更短,并可同时测试多种不同类型的杀菌剂,各项技术参数也都能满足测定工作的要求。