超高效液相色谱-串联质谱法测定工作场所空气中14种环境激素的含量

凌云杉,刘 仲

(1.山东省职业卫生与职业病防治研究院,山东第一医科大学附属职业病医院,济南 250062;2.济南市疾病预防控制中心,济南 250021)

环境内分泌干扰物(EEDs)又称环境激素,是指一种外源性物质,人体摄入环境激素会对体内正常分泌物质的合成、释放、运转代谢、结合等过程形成干扰,使内分泌系统功能受到激活或抑制,从而破坏机体内环境的稳定性[1-3]。大量流行病学资料和临床研究表明,生殖障碍、发育异常、代谢紊乱及某些癌症的发生与环境激素有密切的关系[4]。在工业化发展迅速的今天,发现越来越多的物质属于环境激素,这些物质分布在人们日常生活的方方面面,特别是从事部分职业的人群很容易因接触这些物质而受到潜在的危害[5-10]。

关于食品中环境激素的检测方法研究较多,常用的实验室检测方法有高效液相色谱-电化学法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、电化学传感器法等[11-38],但关于空气,特别是工作场所空气中环境激素的检测方法研究不多。本工作选取使用范围广、健康效应大的14种环境激素(雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯双酚A、17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、双酚A、四溴双酚A、壬基酚、4-正辛基酚、双酚F),利用玻璃纤维滤膜富集、超声洗脱,结合超高效液相色谱-串联质谱法测定工作场所空气中上述14种环境激素的含量,该方法使用外标标准曲线法对14种环境激素进行定量检测,快速、准确,排除干扰效率较高。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters I-class型超高效液相色谱仪;ABI 5500Trap型离子肼与三重四极杆串联质谱仪;KQ5200DV型水浴超声仪;XS205 UD型电子分析天平;Milli-QIntegral Cabinet 5型超纯水机;Gilair pl us型空气采样器;SF-750型超低容量电动喷雾器;37 mm玻璃纤维滤膜,用前需置于500℃马弗炉中加热净化4 h。

单标准储备溶液:1 000 mg·L-1,分别精密称取10.0 mg标准品,用甲醇溶解并定容至10 mL,充分摇匀,于4℃避光保存。

单标准溶液:1.0 mg·L-1,分别取适量标准储备溶液置于10 mL容量瓶中,用10%(体积分数,下同)甲醇溶液稀释并定容,于4℃避光保存,此溶液至少可保存7 d。

混合标准溶液系列:取适量单标准溶液,用10%甲醇溶液逐级稀释,配制成雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯双酚A的质量浓度分别为0.50,1.0,2.0,4.0,5.0,10.0μg·L-1,17α-雌 二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、双酚A、四溴双酚A、壬基酚、4-正辛基酚、双酚F的质量浓度分别为5.0,10.0,20.0,40.0,50.0,100.0μg·L-1的 混 合 标准溶液系列,于4℃保存备用。

雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯双酚A、17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、双酚A、四溴双酚A、壬基酚、4-正辛基酚、双酚F标准品的纯度均大于99.5%;甲醇、乙腈均为色谱纯;试验用水为去离子水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters Sy mmetry C18色 谱 柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)及 对 应 的C18保 护 柱(10 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温30℃;进样体积3μL;流量0.2 mL·min-1;流动相A为乙腈,B为水。梯度洗脱程序:0～3.0 min时,A为50%;3.0～4.0 min时,A由50%升至70%,保持4.0 min;8.0～8.1 min时,A由70%跳转至90%,保持0.9 min;9.0～9.1 min时,A由90%跳转至50%,保持0.9 min。

1.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离源,负离子(ESI-)模式,离子源温度500℃;气帘气压力240 k Pa,雾化气压力345 k Pa,辅助加热气压力345 k Pa,碰撞气压力35 k Pa;喷雾电压4 500 V;采用多反应监测(MRM)模式;其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集

短时间采样(用于检测职业工人短时间接触的激素):在采样点,打开装好玻璃纤维滤膜的采样夹,以流量5 L·min-1采集空气样品15 min,同时采集空白样品。

长时间采样(用于检测职业工人长时间接触的激素):在采样点,打开装好玻璃纤维滤膜的采样夹,以流量1 L·min-1采集空气样品4～8 h,同时采集空白样品。

1.3.2 样品的处理

取采样后的玻璃纤维滤膜于干净的具塞玻璃比色管中,加入5 mL体积比为8∶2的甲醇-水混合液,超声洗脱10 min,洗脱液按仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

为达到良好的分离效果和灵敏度,试验尝试了以不同体积比的甲醇-水混合液、乙腈-水混合液为流动相体系时的梯度洗脱程序,最终确定了1.2.1节所述的梯度洗脱程序。在该流动相梯度洗脱程序下14种环境激素出峰时间在1.09～5.75 min内,分离效率较高。在选定的梯度洗脱程序下进行质谱MRM检测时,各离子的峰形良好。

图1为该梯度洗脱程序下14种环境激素的质量色谱图。

图1 14种环境激素的质量色谱图Fig.1 Mass chro matogra ms of 14 environmental hor mones

2.2 质谱条件的优化

用泵以7μL·min-1的速率将0.01～0.1 mg·L-1的单标准溶液导入离子源,找出母离子、子离子,逐步优化每个离子对的去簇电压和碰撞电压等质谱参数,使得选定离子对信号最强。在找到定量离子、定性离子的质谱参数的基础上,利用针泵连续进样的方式对雾化气压力、辅助加热气压力和离子源温度等进行优化,优化的质谱条件见1.2.2节。

2.3 空气富集条件的优化

试验采用超低容量喷雾法,将甲醇溶液中的14种环境激素喷到1 m3的玻璃容器中,分别用活性炭管、硅胶管、玻璃纤维滤膜进行样品采集。结果表明,活性炭管、硅胶管和玻璃纤维滤膜对14种环境激素的平均富集效率分别为35.7%～56.2%,44.2%～74.1%和76.2%～91.5%,玻璃纤维滤膜富集效率最高。因此,试验选择采用玻璃纤维滤膜进行富集。

2.4 洗脱溶剂的优化

以加标玻璃纤维膜为研究对象,试验分别以甲醇、乙腈、体积比为8∶2的甲醇-水混合液、水为洗脱溶剂进行测试,考察了洗脱溶剂对14种环境激素回收率的影响。结果表明:以水为洗脱溶剂时,14种环境激素的回收率为45.7%～66.9%;以甲醇、乙腈和体积比为8∶2的甲醇-水混合液为洗脱溶剂时,14种环境激素的回收率为67.6%～119%,甲醇、乙腈和8∶2的甲醇-水混合液对环境激素的洗脱效率无明显区别。考虑到有机溶剂用量,试验选择体积比为8∶2的甲醇-水混合液为洗脱溶剂。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以环境激素的质量浓度为横坐标,以定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。所得14种环境激素的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

以3倍信噪比(S/N)计算各环境激素的检出限(3S/N),以10倍信噪比计算各环境激素的测定下限(10S/N),结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of deter mination

结果表明:14种环境激素的质量浓度在一定范围内与相应定量离子峰面积呈线性关系,相关系数为0.995 1～0.999 9。雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯双酚A检出限为0.1μg·L-1,17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、双酚A、四溴双酚A、壬基酚、4-正辛基酚、双酚F检出限为0.5μg·L-1。

2.6 精密度和回收试验

在空白玻璃纤维滤膜中加入标准溶液,配制雌酮、己烯雌酚、三氯生、三氯卡班、四氯双酚A的质量浓度分别为0.75,2.5,4.0μg·L-1,17α-雌二醇、17β-雌二醇、17α-炔雌醇、雌三醇、双酚A、四溴双酚A、壬基酚、4-正辛基酚、双酚F的质量浓度分别为5.0,10.0,50.0μg·L-1的加标样品。每个浓度水平分别处理6个样品,按照试验方法进行回收和重复性试验。每个浓度水平的加标样品在不同时间分6次处理和测定,进行重现性试验。计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (续)

结果表明:14种环境激素的回收率为67.6%～119%,重复性和重现性试验所得RSD分别为1.2%～11%和1.4%～12%。

2.7 样品分析

对环境激素类化学品生产车间的工作场所空气进行长时间采样,采集样品20份,按照试验方法测定,结果显示所检测的14种环境激素在空气中的含量均低于检出限。

本工作将工作场所空气用玻璃纤维滤膜富集、超声洗脱后,采用超高效液相色谱-串联质谱法测定14种环境激素的含量,操作简便。该方法不仅灵敏度高、回收率好,而且重复性和重现性也很好,14种环境激素可实现同步分析,适用于工作场所空气中环境激素的定性定量检测、污染情况评价。