HPLC法测定食醋中的脱氢乙酸

◎ 李宇栋，李守俊，王浩豪，马 婷，李亚楠

（晋城市综合检验检测中心 山西 晋城 048000）

脱氢乙酸钠是一种食品添加剂，具有抗菌谱广、相对稳定、安全性高等优点，在我国被允许在一定范围内使用于黄油、腌渍蔬菜等12 类食品中[1]。杨德中等[2]对2020—2021年市售的18 个类别1 867 份食品中防腐剂使用情况调查研究发现，脱氢乙酸检出率为9.69%。近几年国家食品安全监督抽检任务中将食醋中的脱氢乙酸及其钠盐（以脱氢乙酸计）作为抽检对象，而且国家市场监管总局于2021年7月要求加强食醋质量安全的监督管理[3]，因此找出一种能够准确测定食醋中脱氢乙酸钠含量的方法十分必要。

目前，脱氢乙酸多依据《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）进行检验，该标准中有气相色谱法和液相色谱法两种方法[4]，其中液相色谱法前处理简便，仪器配置普遍，许多实验室选择液相色谱法进行样品中脱氢乙酸的含量测定。然而此国家标准中的试样制备与提取部分未对食醋的前处理作出明确规定，若按照复合调味料类别进行操作，当称样量接近5 g 时，由于液体样品体积较大，再加入其他溶液，在调节pH 值时会出现体积超过定容体积的情况，导致实验失败。同时，本实验室在按照此国家标准中的液相色谱参考条件上机时，脱氢乙酸经常出现严重的拖尾现象，影响定量。王峰[5]采用CAPCELL PAK MG-C18柱超高效液相色谱法对食品中的脱氢乙酸进行测定，取得了良好的结果。于喆源等[6]通过对流动相pH 值、有机相比例、色谱柱填料等仪器条件进行研究发现脱氢乙酸在中性或碱性环境下，烯醇互变后的-O-结构次级保留是造成峰形不对称和保留时间漂移的主要原因。因此通过使用封尾工艺色谱柱，采用酸性流动相并调节有机相比例能够获得理想的保留时间和峰形。目前，未有人对食醋中的脱氢乙酸含量的测定作出具体研究，因此本文通过优化试验条件，提出改进方法，旨在找出适合食醋中脱氢乙酸含量测定的检验方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液相色谱仪：ThermoFisher U3000，配紫外检测器；色谱柱：ThermoFisher Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；十万分之一天平：梅特勒XPE205；pH 计：梅特勒FE20；脱氢乙酸标准品：上海安谱璀世标准技术服务有限公司生产，批号：220425，含量99.9%。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液（1.029 0 mg·mL-1）

精密称取51.50 mg 脱氢乙酸标准品至50 mL 量瓶中，用5 mL 氢氧化钠溶液（20 g·L-1）溶解并用水定容至50 mL，稀释至刻度摇匀，浓度为1.029 0 mg·mL-1。4 ℃避光保存，有效期为3 个月。

1.2.2 较高浓度标准曲线工作液

分别精确吸取脱氢乙酸标准贮备液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀释并定容，配制成浓度为1.03 μg·mL-1、10.29 μg·mL-1、51.45 μg·mL-1、102.90 μg·mL-1和205.79 μg·mL-1标准工作液。4 ℃保存，有效期为1 个月。

1.2.3 较低浓度标准曲线工作液（该标准曲线目的为准确测定低加标水平回收率）

准确吸取标准储备溶液1 mL，用水定容至10 mL，得浓度为102.9 μg·mL-1的标准中间溶液。再分别精确吸取脱氢乙酸标准中间溶液0.05 mL、0.10 mL、0.30 mL、0.50 mL 和1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用水稀释并定容，配制成浓度为0.51 μg·mL-1、1.03 μg·mL-1、3.09 μg·mL-1、5.14 μg·mL-1、8.23 μg·mL-1和10.29 μg·mL-1标准工作液。

1.3 色谱条件

1.3.1 通用条件

检测波长：293 nm；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃。

1.3.2 对比考察条件

第1～2 组：流动相为0.02 mol·L-1乙酸铵+甲醇=90+10，色谱柱分别为C18未封尾色谱柱和C18封尾色谱柱。

第3～5 组：C18封尾色谱柱，流动相为0.02 mol·L-1乙酸铵（分别用乙酸调节pH 值为7.0、6.0、5.0）+甲醇=90+10。

第6～8 组：C18封尾色谱柱，流动相为0.02 mol·L-1乙酸铵（用乙酸调节pH=5）+甲醇分别为90+10、85+15、75+25。

1.4 样品处理

1.4.1 第1 组

样品置于50 mL 离心管中，加入约10 mL 水，用氢氧化钠溶液调pH 值至7.5，转移至50 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，置于离心管中，4 000 r·min-1离心10 min。取20 mL 上清液用10%的甲酸溶液调pH 值至5，定容到25 mL，供高效液相色谱测定。

1.4.2 第2 组

样品依据第1 组方法定容到25 mL 后。取5 mL过已活化的C18固相萃取柱，用5 mL 水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2 mL，涡旋混合，过0.45 μm 有机滤膜，供高效液相色谱测定。

1.5 精密度和准确度

选用基质空白食醋样品5 g，分别加入0.25 mL、0.50 mL 浓度为102.9 μg·mL-1的标准使用液、0.25 mL浓度为1.029 mg·mL-1的标准储备液，形成含量为0.005 g·kg-1、0.010 g·kg-1、0.050 g·kg-13 个加标水平，按照优化后的前处理方法及上机条件进行测定，平行处理6 组，考察方法的准确度、精密度。

2 结果与分析

2.1 色谱柱对脱氢乙酸峰形的影响

《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）规定，在检验食品中的脱氢乙酸时使用C18反相色谱柱，但在试验过程中往往会出现拖尾峰。为考察色谱柱对脱氢乙酸峰形的影响，使用第1～2 组色谱条件，上机测定浓度为10.29 μg·mL-1的脱氢乙酸标准溶液，结果如图1所示。由图1可知，采用C18未封尾色谱柱，峰不对称度2.08；采用C18封尾色谱柱，不对称度0.56，未封尾的色谱柱由于其表面未键合的硅羟基与脱氢乙酸的C-O-结构发生次级保留而出现峰形拖尾，而且拖尾因子还会随着上机浓度的增加而增大。因此，在实验室对脱氢乙酸进行检验时，宜采用封尾工艺色谱柱以得到稳定的色谱响应。

图1 色谱柱对脱氢乙酸峰形的影响图

2.2 流动相对脱氢乙酸峰形及保留时间的影响

图2为采用封尾工艺C18色谱柱，脱氢乙酸上机浓度为50 μg·mL-1时，不同pH 值流动相（第3～5 组色谱条件）对峰形和保留时间的影响。由图2可知，随着流动相pH 值变低，峰形的对称性得到显著改善，但同时脱氢乙酸的保留时间也逐渐增长。

图2 流动相pH 值对峰形及保留时间的影响图

图3为采用封尾工艺C18柱，流动相中的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液用乙酸调节pH=5.0，不同比例有机相（第6～8 组）对保留时间的影响，甲醇比例是10%、15%、25%分别对应的保留时间为50.730 min、31.155 min、14.530 min。由图3可知，随着甲醇有机相比例的升高，保留时间逐渐缩短。因此为了得到良好的峰形并且缩短检测时间，0.02 mol·L-1乙酸铵（pH=5）+甲酸=25+75 更适合脱氢乙酸的分析。

图3 不同流动相比例对保留时间的影响图

2.3 固相萃取对样品中脱氢乙酸峰形的影响

图4是同一市售食醋是否通过固相萃取净化处理的色谱图。由图4可知，部分食醋在脱氢乙酸保留时间附近会出现杂质峰，若出现杂质峰不易分离的情况，可使用固相萃取柱净化的方式除去杂峰。

图4 固相萃取净化对色谱峰的影响图

2.4 标准曲线线性、精密度、准确度和方法检出限、方法定量限

经过上述实验，确定高效液相色谱法测定食醋中脱氢乙酸含量的最佳色谱条件为0.02 mol·L-1乙酸铵（乙酸调节pH=5.0）+甲醇=75+25 为流动相，使用封尾工艺的C18色谱柱，在293 nm 下对经过C18固相萃取小柱净化处理后的样品上机测定。

使用1.2 配制的标准曲线工作溶液，采用上述色谱条件，以浓度为X轴、峰面积为Y轴绘制标准曲线，回归方程为0.51～10.29 μg·mL-1，Y=0.553 9X-0.089，r=0.999 5；1.03～205.79 μg·mL-1，Y=0.558X+0.128，r=0.999 9。在该条件下，取样品5.0 g 两份，分别加入10 μg 和25 μg 脱氢乙酸标准品。按照样品处理方法处理后上机，信噪比分别为9.3 和13.2，符合国家标准《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）对检出限、定量限的规定。由表1可知，该方法的回收率及RSD 值均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的相关要求，说明该方法可在不同水平准确测定食醋样品中脱氢乙酸的含量。

表1 回收率及重复性考察结果表

续表1

3 结论

通过试验分析证明，在测定食醋中脱氢乙酸含量过程中，采用封尾工艺C18色谱柱，0.02 mmol·L-1乙酸铵（乙酸调节pH=5）+甲醇=75+25 流动相体系，柱温30 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长为293 nm 的色谱条件，可以缩短脱氢乙酸的出峰时间，获得稳定的峰形，使用C18固相萃取小柱进行前处理的方法，可以准确检验食醋中的脱氢乙酸含量。