自噬和外泌体在肝纤维化中的研究进展

毕炯炯，马英杰

(1.河南中医药大学第五临床医学院，河南 郑州 450003 2.河南中医药大学人民医院/郑州人民医院消化内科，河南 郑州 450003)

肝纤维化被认为是各种慢性肝病的共同病理基础。在各种致病因素作用下，肝内静止的星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)被激活，转化为肌成纤维细胞，产生大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，形成纤维性疤痕，最终进展为肝硬化甚至肝癌，直接影响患者预后。因该过程具有可逆性，早期逆转肝纤维化过程对慢性肝病的治疗具有重要意义。研究发现，各种癌症、慢性肝病、神经退行性疾病、代谢相关疾病和免疫疾病的发病机制与自噬功能障碍或过度的自噬相关。自噬通量的增加可减缓肝纤维化进程，但二者间的作用关系仍存在争议。同样，在急性或慢性肝病的病理生理学过程中外泌体也发挥重要作用。外泌体可与自噬相互协调，通过溶酶体降解或直接释放到细胞外来维持细胞内稳态。在酒精性肝病动物模型中发现，自噬抑制以及自噬体和溶酶体功能受损与外泌体生成增多有关。同样，外泌体有与自噬通量合作感知细胞稳态的能力。因此，外泌体和自噬之间通过相互关联来支持细胞存活，而这种关联过程是维持肝内稳态的重要环节，但其中的相关机制尚未被阐明。

1 HSCs与肝纤维化

肝纤维化主要是由于ECM过度沉积，其中HSCs激活是关键。生理状态下，HSCs呈静止状态，位于肝窦周Disse间隙内，是维生素A的主要储存场所。肝损伤后，邻近肝细胞通过旁分泌释放大量细胞因子(如TGF-β、PDGF、IL-1β等)作用于HSCs，使其向肌成纤维母细胞样表型转化，导致HSCs增殖和激活,产生大量的ECM。同时，其自身还伴有TGF-β、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型纤维胶原、MMPs、TIMPs等细胞因子分泌的增加，促使HSCs在体内持续激活，并通过其分泌的TIMPs抑制ECM的分解,从而促进肝纤维化，进一步加重肝损伤[1]。活化的HSCs具有促炎和促纤维化特性。此外，HSCs激活后，其分泌的MMPs及其内源性抑制剂TIMPs表达的不平衡也可影响肝纤维化进程。MMP家族负责ECM所有成分的逆转和降解。其中MMP-12、MMP-19能促进纤维化，MMP-1、MMP-8、MMP-13具有抗纤维化特性，表达上调能促进肝细胞增殖，减轻纤维化。在肝纤维化过程中，HSCs的活化过程除了通过各种细胞因子诱导外，还与损伤刺激下诱导的各种信号通路有关，如TGF-β/Smads信号通路、NF-κB信号通路、PI3K/AKT/mTOR信号通路、Hedgehog信号通路等。深入了解影响HSCs活化的因素是肝纤维化防治的重要策略。

2 自噬与肝纤维化

自噬是一种存在于所有有核细胞中的分解代谢过程，具有高度的保守性，主要通过溶酶体降解细胞内的大分子和细胞器，对细胞的生存、分化、生长及内稳态有重要意义。在肝纤维化过程中，自噬参与HSCs活化的机制逐渐被认识，其对HSCs可能具有双重作用。

2.1通过参与脂滴降解，促进肝纤维化:自噬通过参与脂滴降解，为激活HSCs提供能量，增加ECM释放，直接促进肝纤维化。在肝纤维化小鼠模型中，脂多糖诱导的自噬通过介导AKT-MTOR和AMPK-ULK1途径，促使HSCs中自噬体形成和自噬通量增加，诱导脂滴消化，降低视黄醇水解成游离脂肪酸，进一步氧化，为激活HSCs提供能量，并下调Bambi的表达，增加HSCs对TGF-β的纤维化反应的敏感性[2]，促进纤维化。相反的，虾青素被发现能抑制自噬，通过向下调控NF-κB的表达和翻译，抑制HSCs能量供应，缓解肝纤维化[3]。因此，激活HSCs自噬可促进纤维化。

2.2通过抗炎作用，抑制肝纤维化:自噬也能负向调控HSCs的激活，通过抗炎作用，抑制肝纤维化。在CCl4诱导的肝纤维化模型中，自噬抑制剂3-MA可抑制NF-κB易位入核，降低炎症细胞的浸润和胶原的沉积，改善肝纤维化[4]。自噬与肝纤维化之间的作用关系仍存在争议。此外，在肝纤维化进程中，因细胞类型的差异，自噬具有不同的特性。肝窦状内皮细胞(liver endothelial cells，LSECs)中自噬基因Atg7缺失导致细胞功能障碍，使其抗氧化应激能力下降，加重纤维化，但过度的自噬激活可导致caveolin-1降解，损伤LSECs的防御功能，最终促进纤维化化[5]。因此，LSECs中任何自噬失调都可能加重肝纤维化。自噬在肝纤维化过程中可能发挥促纤维化和抗纤维化双重作用，选择性调控纤维化细胞的自噬可能是未来抗纤维化治疗新方法。

3 外泌体分泌与肝纤维化

外泌体是由晚期核内体或多囊泡体的膜向内出芽形成，包括脂质、蛋白质、mRNAs、miRNAs和lncRNAs等多种载体，这些生物活性物质能从供体细胞转移到受体细胞，从而调控受体细胞的生物学功能，并介导细胞间通讯。由外泌体介导的蛋白质和miRNAs转运是肝纤维化进程中的关键机制。在肝纤维化过程中，外泌体可介导并促进相邻的HSCs、LSECs、Kupffer细胞和肝细胞之间细胞间通信的分泌功能，从而诱导HSCs的激活和迁移。外泌体的数量及种类会受到肝脏微环境改变的影响。大量研究证实HSCs可作为外泌体的受体细胞发挥作用。如：肝细胞外泌体miR-27a负向调控PINK1介导的线粒体自噬，促进HSCs的活化和增殖，从而加速代谢相关脂肪性肝病的纤维化。巨噬细胞外泌体miR-103-3p可被邻近的HSCs吸收，并通过抑制KLF4因子促进HSCs的激活[6]。不同细胞来源的外泌体可通过调控自噬或者靶向调节信号通路等途径，抑制HSCs活化，缓解肝纤维化。来自人骨髓间充质干细胞的外泌体通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来阻止HSCs的激活，降低α平滑肌肌动蛋白(SMA)和I型胶原蛋白的表达,减少胶原积累，抑制炎症，增加肝细胞再生，从而改善肝功能，减缓肝纤维化[7]。脂肪源性间充质干细胞的外泌体miR-181-5p通过抑制HSCs的活化，靶向作用于Stat3和Bcl2，从而增加自噬，减少TGF-β1诱导的肝纤维化进程[8]。NK细胞外泌体miR-223可以通过降低自噬基因Atg7水平，抑制自噬，从而阻止TGF-β1诱导的HSCs激活[9]。此外，HSCs也可作为外泌体的供体细胞。HSCs的外泌体miR-214可以穿梭于HSCs和肝细胞之间，调节小鼠原代肝细胞中的CCN2表达，而外泌体miRNA-199a-5p则靶向调节CCN2，抑制HSCs中纤维生成信号通路。目前关于HSCs作为外泌体供体细胞的作用以及这些外泌体对肝脏微环境影响的研究较少。

4 外泌体和自噬在肝纤维化中的关联

自噬分子参与晚期核内体的分布，外泌体的释放以及核内体转运机制的组成也与自噬体的成熟有关。此外，外泌体不但可以通过封装自噬蛋白作为载物来影响自噬水平，还可以通过介导相关信号通路，如mTOR信号通路、TGF-β1/Smads信号通路等参与自噬调控。同样的，自噬通量增加会抑制外泌体的释放并诱导其溶酶体降解。两种途径交叉调控，影响着各种疾病的发展，且环境依赖性是影响二者相关作用的关键因素。

4.1外泌体调控自噬：外泌体对自噬的影响取决于其亲代细胞和刺激条件。二者可能协同作用来对抗细胞应激反应。在急性肝衰竭中应用人骨髓间充质干细胞外泌体可以显著降低caspase-3和Bax的水平，并上调Bcl-2的表达，从而减轻肝细胞凋亡并促进自噬。脂肪源性间充质干细胞外泌体可以通过激活自噬来改善肝纤维化。过表达的miR-29a可以通过降低LC3BII和p-ULK的水平来减轻自噬，从而减轻BDL小鼠的肝损伤和纤维化[10]。由此可见，外泌体可通过传递特定的miRNA调控靶细胞自噬，来促进疾病的病理生理学进程。目前尚未确定自噬受损的肝细胞是否会释放特定的外泌体来影响肝纤维化进程。

4.2外泌体调控自噬相关信号通路

4.2.1mTOR信号通路：Zou[11]等发现mTOR作为mTOR信号通路的下游信号分子，直接负向调控细胞自噬的同时又能通过下调外泌体标记物来抑制肝细胞中的外泌体释放。在不利条件下，mTOR通路受到抑制，外泌体与自噬均上调。Gao[12]等发现，PDGF及其下游信号分子SHP2能够抑制mTOR内源性抑制剂REDD1的表达，从而增强mTOR信号和外泌体释放。相反，mTOR信号通过抑制自噬和激活ROCK1信号通路促进外泌体释放。这些外泌体可诱导HSCs的迁移，导致促纤维化信号的放大。mTOR信号通路是抑制还是诱导外泌体分泌仍存在争议，最终作用可能与靶细胞类型有关。此外，外泌体可以与自噬的关键调控因子PI3K/Akt/mTOR或AMPK/mTOR通路相互作用，分别通过减少过度自噬或诱导自噬来促进细胞生存[13]。

4.2.2TGF-β1/Smads信号通路:TGF-β1是导致肝纤维化的重要细胞因子之一。外泌体可通过下调TGF-β1/Smads信号通路来抑制自噬，改善肝纤维化。来自MSCs的外泌体miR-618通过负向调控Smad4来抑制肝纤维化的进展[14]。外泌体miR-122通过下调TGF-β1/Smad信号通路来抑制TGF-β1诱导的LX-2细胞上皮间质转化过程[15]。过表达的miR-210能负向调节Smad4，增加缺氧/复氧诱导的原代肝细胞凋亡[16]。相反的，脂多糖处理的巨噬细胞外泌体中高表达的miR-500可靶向抑制MFN2，从而通过TGF-β/Smads信号通路促进HSC的增殖和活化，加速肝纤维化。血清外泌体miR-500可作为晚期肝纤维化诊断的生物标志物。

4.2.3Hedgehog信号通路:Hedgehog信号通路主要由Hh配体、蛋白受体Ptc与Smo、转录因子Gli组成[17]。由于自噬，凋亡的肝细胞可以释放大量的Hh配体，这些配体与HSCs上的相关受体结合，最终激活Hh信号通路和HSCs，导致肝纤维化的发生。在原发性肝癌动物模型中发现，Gli1诱导MIRLET7BHG转录的激活，上调Smo，并经原发性肝癌来源的外泌体传递，介导hedgehog途径激活HSCs，从而促进原发性肝癌的发生，为治疗原发性肝癌提供了一条新的途径[17]。

4.2.4其他信号通路：NF-κB信号通路多参与炎症反应，而关于肝纤维化的研究较少。现有研究认为下调NF-κB信号通路可抑制自噬，缓解肝纤维化。外泌体miR-378通过上调NF-κB通路促进肝纤维化的进展[18]。Wnt/β-catenin信号通路传导与HSCs活化有关。在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，人类骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HSCs的活化，从而改善纤维化。外泌体miR-30a通过靶向Beclin-1信号通路抑制自噬，在心肌梗死和肝纤维化中发挥重要作用。

4.2.5lncRNA/miRNA/自噬相关基因轴：外泌体lncRNAs可以通过lncRNA/miRNA/自噬相关基因轴或miRNA/自噬相关基因轴影响自噬水平，促进纤维化程度。Xie[19]等发现敲除原发性肝癌中高表达的lncRNA-SNHG7后，miR-29b表达下调，DN-MT3A表达上调，促进HSCs活化和自噬。这一结果提示lncRNA-SNHG7/miR-29b/DNMT3A轴参与了自噬诱导的肝纤维化。lncRNAs为肝纤维化的诊断和治疗提供了更多的靶点。

5 小 结

在肝纤维化进程中，自噬和外泌体途径都受到影响，不同肝细胞类型决定了自噬水平的上调或下调，从而表现出抗纤维化和促纤维化特性。同样，外泌体介导的细胞通讯作用，也能够通过激活受体细胞的不同信号通路改变其功能，影响HSCs的激活和迁移，调控炎症反应、自噬以及氧化应激等，最终缓解肝纤维化的进展。两者在纤维化过程中存在相互串扰和重叠，这种交叉调节关系仍存在争议，而通过干预二者间共享的作用靶点，能否达到抗纤维化的放大效应尚未明了，有待继续研究。现阶段关于外泌体调控自噬的研究，多集中在以miRNA调控自噬为主的基础实验上，深入研究发现lncRNA也可通过自噬影响肝纤维化进程，未来可继续探讨外泌体中其他生物活性物质对自噬的调控作用，为肝纤维化的治疗提供新的思路。