Keap1-Nrf2-ARE通路在阿尔茨海默病发病机制中的潜在作用

孙亦轩, 王俊力, 邵 卫,

(1.湖北中医药大学, 湖北 武汉 430065 2.湖北省武汉市第一医院，湖北 武汉 430030)

阿尔茨海默病(AD)是严重的全球健康问题，发病率很高，而其发病机制假说众多，有Aβ级联假说、胆碱能假说、Tau蛋白异常磷酸化假说、神经炎症假说、金属离子紊乱假说等，但仍未能有效解释AD的发病过程。越来越多的文献表明Keap1-Nrf2-ARE信号通路与AD的病理变化之间可能存在联系。Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-核因子红系2相关因子2(Nrf2)信号通路被认为是多器官防御氧化应激的关键调控过程。通过探讨Keap1-Nrf2-ARE信号通路如何调控氧化还原分子以及与AD的联系，这可能有助于发现AD的发病机制以及一些靶向此途径的化合物，也可能可以提供新的治疗策略。

1 氧化应激与AD

氧化应激是由于活性氧(ROS)，如过氧化氢、次氯酸、超氧自由基和羟基自由基的增加而导致体内氧化水平超过抗氧化防御而发生的损害。大量的报告表明，活性氧和氧化应激在AD中通过具有有害的生物分子，特别是蛋白质在起作用。而氧化应激中的中心环节就是线粒体的功能失调。有科学家根据观察AD患者中的线粒体功能失调从而提出了线粒体级联假说，该假说指出，在散发性迟发性AD中，与年龄相关的线粒体功能丧失会影响APP的表达和处理，从而引发积累[1]。线粒体功能障碍已在AD中得到充分证明，在多个家族性AD转基因小鼠模型的胚胎神经元中已经观察到异常的线粒体轴突运输，在淀粉样斑块或记忆损伤发生之前检测到线粒体分裂、融合和功能的异常[2]。活性氧产生和抗氧化防御之间的平衡对正常细胞功能至关重要。然而，在AD中，抗氧化酶的活性发生改变，从而导致氧化损伤的无限制累积。当不平衡时，ROS的过度产生和抗氧化防御不足相结合会导致氧化应激。有证据表明，导致ROS产生增加的线粒体损伤出现在AD临床症状出现和病理学出现之前的早期阶段[3]。研究者们还在死后的脑组织和外周系统中发现了RNA、细胞核和线粒体DNA的氧化修饰，包括AD和ApoE4携带者临床前或早期阶段的细胞和分离线粒体[4]。线粒体活性氧可破坏线粒体膜电位，加速同一细胞器内活性氧的产生，因此，一小部分细胞器中活性氧生成的增加足以将活性氧损伤传播到其他线粒体，最终影响整个细胞。因为在AD中观察到了大量的氧化应激现象，就有科学家提出了通过抗氧化来治疗AD。而Keap1-Nrf2-ARE信号通路就是细胞氧化应激中的关键通路，其调控的下游靶蛋白NQO1、HO-1等在抗氧化中起着非常重要的作用，且大量研究发现Nrf2信号通路与AD之间存在关联，这可能有助于发现AD的发病机制。

2 Keap1-Nrf2-ARE信号通路概述

核因子红系2相关因子2(Nrf2)是碱性区亮氨酸拉链型转录因子的帽状n领(CNC)亚家族，1994年由P Moi等首次分离。Nrf2蛋白包含七个Nrf2 ECH同源(Neh)结构域。Neh1结构域是与小Maf蛋白二聚的DNA结合结构域，位于Nrf2 N端的Neh 2结构域通过DLG和ETGE基序介导与Keap1的相互作用，并包含七个赖氨酸残基，它们是泛素化的目标。Neh 3、Neh 4和Neh 5域是反式激活域，Neh 6结构域是一个调节Nrf2稳定性的富含丝氨酸的区域，Neh 7结构域参与维甲酸X受体α(RXRα)结合[5]。

Nrf2分离五年后，Ken Itoh等首先命名Keap1，并确定Keap1通过结合Nrf2抑制抗氧化反应元件的核激活。Keap1是基于Cullin 3(Cul3)的泛素E3连接酶的适配器亚单位。生理学上，Keap1与Nrf2结合，导致Nrf2处于非活性且易于降解的状态。当受到自由基或化学应激刺激时，Keap1-Cul3复合物的泛素E3连接酶活性下降，Nrf2从Keap1-Nrf2-ARE复合物解离并进入细胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合，导致ARE下游基因的转录和表达，包括许多抗氧化和解毒酶的基础和诱导表达[6]。

ARE，也称为β-萘黄酮响应元件(β-NF-RE)，分为四类。Ⅰ类和Ⅲ类基因由AP-1激活，而Ⅰ类和Ⅱ类基因由Nrf2诱导。ARE是对抗氧化应激的信号转导途径的中心部分。Keap1/Nrf2/ARE途径控制抗氧化系统关键成分的表达，以维持氧化还原稳态，如GSH和TXN、血红素加氧酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶(NQO1)。该信号通路调节100多个与抗氧化应激和细胞存活相关的基因和功能的表达，包括直接抗氧化蛋白、Ⅰ期和Ⅱ期亲电解毒酶、有毒溶质的运输、自由基代谢、炎症抑制、谷胱甘肽内稳态，蛋白酶体功能、DNA损伤识别以及各种相关生长因子和转录因子的表达[7]。

3 Keap1-Nrf2-ARE信号通路与AD的关系

Keap1-Nrf2-ARE途径现在被认为是AD和其他神经退行性疾病的有希望的靶点。首先，Keap1-Nrf2-ARE途径与一些与AD相关的标记分子的表达密切相关，例如Aβ、tau蛋白等。其次，Keap1-Nrf2-ARE途径与参与AD发展的其他途径密切相关，如乙酰胆碱酯酶传递、线粒体功能障碍、神经炎症等。

3.1Nrf2与Aβ:β淀粉样蛋白(Aβ)是AD病人脑内老年斑周边神经元沉积的病理产物，是AD的重要病理因素。Nrf2基因缺失的APP/PS1小鼠表现出炎症反应增强，同时APP、Aβ1-42和Aβ1-40的细胞内水平升高，来自Nrf2缺陷APP/PS1小鼠的神经元也表现出内小体、溶酶体和多泡体的增加积累[8]。这些发现为Nrf2在APP/Aβ加工和积累以及自噬功能障碍中的作用提供了线索。Kerr等证明通过特异性抑制Keap1激活Nrf2可防止AD引发的Aβ42肽引起的神经元毒性[9]。Yu等的一项研究也显示了在AD动物模型中使用Nrf2激活剂异落新妇苷可以使Aβ1-42水平和p-tau均降低[10]。Bahn等发现，Nrf2通过结合BACE1启动子中的AREs抑制AD动物模型中BACE1的表达。Nrf2激活降低BACE1转录物和Aβ的产生，并改善认知缺陷。另一方面，Nrf2的缺失增加了BACE1的表达和Aβ的生成，并加重了认知缺陷。作者还披露，BACE1的Nrf2调节独立于ROS抑制[11]。这项研究不仅将Nrf2的功能与Aβ的产生联系起来，而且还揭示了Nrf2抑制BACE1的能力。相反，该研究还表明Nrf2不影响γ-分泌酶的活性或表达。这些发现表明，Nrf2激活不仅抑制Aβ的产生，而且还减少了其聚集引起的损伤。

3.2Nrf2与p-tau:Tau病理学被认为是AD认知能力下降和神经退行性变的主要驱动因素。Jo等的一项研究表明，Nrf2可以通过诱导核点蛋白52(NDP52)来降低p-tau的水平。NDP52是一种自噬衔接蛋白，其诱导促进自噬介导的p-tau降解。Jo等还揭示了这种Nrf2活性的机制，其结果是Nrf2与NDP52启动子中的AREs结合[12]。最近，还有科学家报道Nrf2调节选择性自噬过程，有助于清除tau。他们观察到老化的Nrf2-/-动物中BAG3、NBR1、NDP52和p62的表达与年轻Nrf2-/-中的动物比较显著降低，表明Nrf2在衰老期间维持这些基因的适当表达水平方面起着关键作用[13]。许多Nrf2激活剂，如富马酸二甲酯和大蒜素对p-tau AD动物模型显示出积极作用[14,15]。

3.3Nrf2与神经炎症:小胶质细胞活化和神经炎症为AD病理学的一大重要特征。在AD中，Aβ斑块区域附近的小胶质细胞可能被慢性激活，且NF-κB水平升高，从而导致持续分泌有害的促炎症细胞因子和ROS/RNS，这些过程加速了神经退行性变。此外，Terada等还观察到AD患者海马旁神经炎症与tau病理直接正相关[16]。所有这些发现表明，神经炎症可能在AD的进展和发展中起着至关重要的作用。因此，消除神经炎症可能会减少AD的进展和症状。在神经炎症中NF-κB是重要的转录调节因子，主要诱导促炎因子的产生(IL-6、COX2和iNOS)，而Nrf2诱导基因主要是抗炎(包括CD36、IL-17D)。在这种情况下，Nrf2和NF-κB之间的不平衡可能对AD的发病机制很重要。因此，Nrf2可能在AD中发挥有价值的抗炎作用。一些研究证实，Nrf2激活可抑制Aβ或tau注射引起的小胶质细胞激活，进一步保护神经元损伤[17]。

3.4Nrf2与乙酰胆碱酯酶:乙酰胆碱(ACh)是一种在神经末梢释放的有机神经递质。乙酰胆碱在胆碱能神经元中由乙酰胆碱转移酶(ChAT)产生，ChAT使用乙酰辅酶A和胆碱作为底物。释放后，乙酰胆碱通过乙酰胆碱酯酶(AChE)代谢为胆碱和醋酸盐。在AD患者的大脑中观察到乙酰胆碱水平的缺乏和乙酰胆碱酯酶水平的增加。乙酰胆碱通过乙酰胆碱酯酶的快速水解终止胆碱能突触的脉冲传递。因此，降低活性乙酰胆碱酯酶水平可以增强胆碱能功能。尽管没有明确的证据表明Nrf2对乙酰胆碱酯酶的影响，但几种Nrf2激活剂在AD小鼠模型中显示出对胆碱能功能的积极影响，同时乙酰胆碱酯酶水平降低，乙酰胆碱和乙酰胆碱转移酶水平显著升高[18]。Zhang等发现，在细胞凋亡开始时，乙酰胆碱酯酶存在于细胞质中，在细胞死亡时，乙酰胆碱酯酶存在于细胞核或凋亡小体中。此外，使用药理抑制剂降低活性乙酰胆碱酯酶的水平可以抑制细胞凋亡。他们得出结论，乙酰胆碱酯酶可能是细胞凋亡的标志物和调节器[19]。这可能解释了AD脑内高水平的乙酰胆碱酯酶是因为越来越多的细胞发生凋亡。Nrf2的抗凋亡作用可减少胆碱能神经元的丢失，胆碱能神经元可维持乙酰胆碱的产生，从而最大限度地减少神经认知能力的下降。然而，需要进一步研究乙酰胆碱酯酶在细胞凋亡中的作用以及Nrf2激活对乙酰胆碱酯酶功能和分布的影响。

3.5Nrf2与线粒体功能障碍:线粒体是一种灵活的超微结构细胞器，控制着关键分子元素的生物能量流动。线粒体的整体动力学性质由融合和分裂两种活动控制。融合通过抑制线粒体断裂，可以延缓细胞凋亡的发生，而分裂在细胞凋亡中起着积极的作用。线粒体质量控制过程中的不平衡可能导致线粒体功能障碍。在Nrf2基因敲除小鼠中观察到与年龄相关的线粒体氧化应激以及受损的线粒体功能，而Nrf2激活增强了线粒体功能，抑制了线粒体抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-xL)的表达[20]。线粒体功能障碍在AD早期发生，导致神经退行性变，促进突触损伤和凋亡。APP、Aβ和p-tau可干扰线粒体成分，导致线粒体动力学异常、生物发生缺陷、自噬减少、线粒体吞噬减少、ATP生成受损和氧化损伤增加，Nrf2可减少这些损伤并维持线粒体功能。Nrf2在线粒体保护中的作用是Nrf2激活在AD治疗中的另一个有益作用。

4 Nrf2激活剂在AD临床试验中的应用

自1906年AD出现以来，FDA只批准了5种治疗AD的药物，分别是他克林、利凡斯的明、加兰他敏、多奈哌齐和美金刚。前四种药物均是乙酰胆碱酯酶抑制剂，后一种是一种N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，常用于治疗中重度AD。然而，这些药物均不能终止或逆转AD的进程，且具有广泛的副作用。

Nrf2可直接或间接干扰Aβ和p-tau，Mangialasche在2010年提出了多靶点治疗AD，运用的是乙酰胆碱酯酶抑制剂与抗氧化剂或NMDA受体拮抗剂一起给予，前面也提到Nrf2激活后可以起到抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种作用，所以使用单一的Nrf2激活剂可能比联合多种药物更降低成本、副作用更少，药物相互作用更少。已经有许多天然的或是合成的Nrf2激活剂在神经退行性疾病的实验室研究或临床前模型得到验证[21]。最近，一些参与AD临床试验的药物也被证明能激活Nrf2。2014年，苯磷硫胺被纳入AD临床试验。四年后，Tapias等证明，在P301S AD活体模型中，苯磷硫胺可以激活Nrf2，并降低p-tau[22]。在FDA批准的可激活Nrf2的药物中，富马酸二甲酯被认为是治疗AD的有希望的药物。富马酸二甲酯在不同的AD模型中表现出积极作用，包括黄腐酚、小豆蔻素和绿原酸这些天然存在的药物，都可以通过Nrf2激活发挥神经保护能力。Nrf2的特异激动剂特丁基对苯二酚在实验中被发现可以通过激活Nrf2/ARE信号通路进而降低可溶性Aβ水平从而发挥细胞保护作用并可以诱导抗凋亡蛋白的产生，这表明Nrf2在AD中可以清除病理性沉积物。目前，数十种天然和合成Nrf2激活剂可用于进一步深入研究其在AD模型中的作用。这些化合物可能是药物开发的良好起点。通过化学修饰有可能改善这些分子的化学和药理学性质，以达到更好的治疗效果。

5 展 望

Nrf2信号通路是抗氧化的主要通路，调控着Ⅱ期解毒酶和抗氧化蛋白的生成，Nrf2在AD中除了能改善氧化应激状态外，大量证据还表明其能改善炎症、抑制乙酰胆碱酯酶与线粒体功能障碍，除此之外，其还能抑制Aβ、p-tau等AD病理产物的产生，所以，研制出Nrf2的激活剂似乎能实现多靶点、多途径、多通路的治疗作用，但是,Nrf2通路本身很复杂，可以通过不同的机制激活，且现有的Nrf2激活剂因其下游作用广泛，往往会产生很多副作用，所以，研究如何更好的激活Nrf2以及减少副作用可能是今后研究的重中之重。