白族药倒钩刺化学成分研究

郝 艺 罗晓磊 王 敏 张 伟 肖朝江 姜 北*

1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室，云南 大理 671000； 2.大理大学药学院，云南 大理 671000

白族药用植物倒钩刺为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物三叶悬钩子(RubusdelavayiFranch.)的全草，直立矮小灌木，常生于海拔2000～3000 m的山坡沟谷稀疏灌木丛中[1]。该植物在大理分布广泛，药用全草，夏秋采集，鲜用药效较好，是传统的白族药用植物[2]。据白族医药文献记载，倒钩刺主要用于治疗风湿性关节炎、急性结膜炎、扁桃体炎、腮腺炎、四季感冒、痢疾等[3]。此外，课题组成员在药材市场及民间走访时发现，在大理洱源、喜洲、漾濞、下关一带白族民间还常将倒钩刺用于防治旋毛虫病。另有文献报道，倒钩刺植物还具有体外抗菌[4]、抗炎[5]、抗寄生虫[6]、抗肿瘤[7]等作用。

目前，有关倒钩刺植物化学成分有少量研究报道，分离得到的化合物主要包括萜类、甾体类、黄酮类、酚酸类等成分[8]。为进一步认识倒钩刺的化学成分，明确其药用物质基础，本实验利用多种色谱方法对白族药用植物倒钩刺进行化学成分研究，从中分离得到11个化合物，包括5个三萜类、4个酚酸类、2个甾体类化合物。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Bruker Avance Ⅲ-400核磁共振仪(德国布鲁克公司，TMS为内标)；Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪(美国戴安公司)；Bruker Daltonics MS系统(德国布鲁克公司)；柱色谱用硅胶和GF254薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；MCI CHP-20(75～150 μm)(日本三菱公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(瑞典Amersham Biosciences公司)；D101型大孔树脂(天津波鸿树脂科技有限公司)；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇均为工业级重蒸后使用；异丙醇为分析纯(上海化工有限公司)。

1.2 材料 本实验所用植物样品于2018年10月购自云南大理，由大理大学药学院张德全教授鉴定为三叶悬钩子(RubusdelavayiFranch.)，植物标本(编号：20181019-3)保存于大理大学云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室。

2 提取与分离

倒钩刺干燥全株2 kg，粉碎后用8 L 95%乙醇室温浸提4次，每次24 h，合并滤液减压浓缩得总浸膏308 g，400 mL蒸馏水溶解后经D101型大孔树脂分离，以乙醇-水(0～100%)梯度洗脱得水、50%乙醇及100%乙醇3个洗脱部位。50%乙醇洗脱部位经硅胶柱色谱进行分离，三氯甲烷-丙酮溶剂系统梯度洗脱(1∶0～0∶1)，薄层色谱检测并合并相同流分，得8个组分Frs.A～H。组分Fr.B经硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇(30∶1～1∶1)、石油醚-乙酸乙酯(50∶1～1∶1)反复洗脱得4个亚组分(Fr.B-1-1～Fr.B-1-4)。Fr.B-1-1经硅胶柱色经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮5∶1)等度洗脱得化合物3(7 mg)。Fr.B-1-2经MCI柱色谱(乙醇-水0～100%)梯度洗脱得2个亚组分Fr.B-1-2-1、Fr.B-1-2-2。Fr.B-1-2-1经Sephadex LH-20(甲醇)洗脱得化合物5(100 mg)；Fr.B-1-2-2经硅胶柱色谱(石油醚-乙酸乙酯2∶1)洗脱得化合物6(12 mg)、7(10 mg)。组分Fr.D用MCI柱层析分离，甲醇-水系统梯度洗脱(0∶1～1∶0)，硅胶柱色谱(氯仿-丙酮30∶1～1∶1)梯度洗脱，得6个亚组分(Fr.D-1-1～Fr.D-1-6)。Fr.D-1-1经Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)柱色谱洗脱得3个亚组分(Fr.D-1-1-1～Fr.D-1-1-3)。Fr.D-1-1-2经硅胶柱色谱(环己烷-异丙醇10∶1～4∶1)梯度洗脱得化合物11(10 mg)；Fr.D-1-1-3经Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)柱色谱洗脱得化合物10(8 mg)。Fr.D-1-2经硅胶柱色谱(三氯甲烷-乙酸乙酯20∶1～5∶1)梯度洗脱得化合物8(40 mg)。Fr.D-1-3经Sephadex LH-20(甲醇)柱色谱洗脱得化合物9(10 mg)。组分Fr.F用硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇系统梯度洗脱得9个组分Fr.F-1～Fr.F-9。Fr.F-2经硅胶柱色谱(氯仿-甲醇50∶1～0∶1)梯度洗脱得10个组分Fr.F-2-1～Fr.F-2-10。Fr.F-2-7经硅胶柱色谱(三氯甲烷-异丙醇80∶1～20∶1)梯度洗脱得化合物1(14 mg)；Fr.F-2-10经硅胶柱色谱(石油醚-丙酮10∶1～2∶1)梯度洗脱得化合物2(30 mg)。Fr.F-3经硅胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇50∶1)梯度洗脱得化合物4(10 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：分子式为C30H48O4，白色粉末。1H-NMR(400MHz, C5D5N)δ∶5.48(1H, m, H-12), 4.13(1H, td,J=11.0, 4.1 Hz H-2β), 3.43(1H, dd,J=9.3, 2.9 Hz, H-3α), 2.64(1H, d,J=10.8 Hz, H-18), 1.29, 1.21, 1.09, 0.98, 0.96(each 3H, s, 5×Me), 1.03(3H, d,J=7.4Hz, H-30), 1.01(3H, d,J=7.4 Hz, H-29);13C NMR(100MHz, C5D5N)δ∶47.8(t, C-1), 68.3(d, C-2), 83.6(d, C-3), 39.6(s, C-4), 55.6(d, C-5), 18.6(t, C-6), 33.0(t, C-7), 39.7(s, C-8), 47.8(d, C-9), 38.2(s, C-10), 23.5(t, C-11), 125.3(d, C-12), 139.1(s, C-13), 42.3(s, C-14), 28.4(t, C-15), 24.6(t, C-16), 47.8(s, C-17), 53.3(d, C-18), 39.2(d, C-19), 39.2(d, C-20), 30.7(t, C-21), 37.2(t, C-22), 29.1(q, C-23), 17.3(q, C-24), 16.7(q, C-25), 17.2(q, C-26), 23.7(q, C-27), 179.7(s, C-28), 17.5(q, C-29),21.2(q, C-30)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定该化合物为2α-羟基熊果酸。

化合物2：分子式为C30H48O3，白色粉末。在TLC上经多种溶剂系统分别展开后化合物2与已鉴定化合物乌苏酸的Rf莲值及斑点颜色均一致，故鉴定该化合物为乌苏酸。

化合物3：分子式为C30H46O5，白色粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.30(1H, t,J=4.3 Hz, H-12), 1.32, 1.30, 1.29, 1.19, 1.11, 0.86(each 3H, s, 6×Me), 0.93(3H, d,J=6.9 Hz, H-30);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶50.6(t, C-1), 70.4(d, C-2), 216.0(s, C-3), 48.8(s, C-4), 58.8(d, C-5), 20.4(t, C-6), 33.9(t, C-7), 41.3(s, C-8), 48.2(d, C-9), 38.8(s, C-10), 24.9(t, C-11), 128.9(d, C-12), 140.2(s, C-13), 42.7(s, C-14), 29.6(t, C-15), 26.7(t, C-16), 48.8(s, C-17), 55.0(d, C-18), 73.5(s, C-19), 43.1(d, C-20), 27.0(t, C-21), 38.8(t, C-22), 25.4(q, C-23), 22.1(q, C-24), 17.6(q, C-25), 17.0(q, C-26), 24.8(q, C-27), 183.1(s, C-28), 27.3(q, C-29),16.4(q, C-30)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定该化合物为2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid。

化合物4：分子式为C30H48O4，白色粉末。1H-NMR(400MHz, C5D5N)δ∶5.48(1H, t,J=3.6, 7.3 Hz, H-12), 4.12(1H, td,J=11.0, 4.2 Hz H-2β), 3.42(1H, d,J=9.3 Hz, H-3α), 3.31(1H, dd,J=14.1, 4.5 Hz, H-18), 2.27(1H, dd,J=12.4, 4.4 Hz, H-1), 1.29, 1.27, 1.09, 1.02, 1.01, 0.99, 0.95(each 3H, s, 7×Me),13C NMR(100MHz, C5D5N)δ∶46.2(t, C-1), 68.3(d, C-2), 83.6(d, C-3), 39.6(s, C-4), 55.6(d, C-5), 18.6(t, C-6), 29.6(t, C-7), 39.6(s, C-8), 47.9(d, C-9), 38.3(s, C-10), 23.5(t, C-11), 122.2(d, C-12), 144.6(s, C-13), 42.0(s, C-14), 28.0(t, C-15), 23.7(t, C-16), 46.4(s, C-17), 41.7(d, C-18),47.5(t, C-19), 30.7(s, C-20), 34.0(t, C-21), 33.1(t, C-22), 29.1(q, C-23), 17.5(q, C-24), 17.2(q, C-25), 16.6(q, C-26), 25.9(q, C-27), 180.0(s, C-28), 33.1(q, C-29), 23.4(q, C-30)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定该化合物为maslinic acid.

化合物5：分子式为C30H48O4，白色结晶(丙酮)。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶4.67(1H, d,J=1.9 Hz H-29α), 4.67(1H, d,J=1.9 Hz H-29β),3.57(1H, td,J=4.7, 10.3, 10.4 Hz, H-3), 2.89(1H, m, H-19),2.83(1H, d,J=9.6 Hz H-3), 1.65, 0.94, 0.90, 0.87, 0.77, 0.72(each 3H, s, 6×Me);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶48.5(t, C-1), 69.5(d, C-2), 84.4(d, C-3), 40.5(s, C-4), 56.8(d, C-5), 19.5(t, C-6), 35.5(t, C-7), 42.0(s, C-8), 52.1(d, C-9), 39.5(s, C-10), 22.2(t, C-11), 26.8(t, C-12), 39.5(d, C-13), 43.6(s, C-14), 30.8(t, C-15), 33.3(t, C-16), 57.5(s, C-17), 50.4(d, C-18), 48.5(d, C-19), 152.0(s, C-20), 31.7(t, C-21), 38.1(t, C-22), 29.2(q, C-23), 17.3(q, C-24), 17.9(q, C-25), 16.6(q, C-26), 15.1(q, C-27), 180.0(s, C-28), 110.2(t, C-29),19.5(q, C-30)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定该化合物为alphitolic acid。

化合物6：分子式为C29H50O2，白色固体。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.49(1H, d,J=4.9 Hz, H-6), 3.72(1H, s, H-7), 3.41(1H, m, H-3), 1.03(3H, s, H-19), 0.91(3H, d,J=6.7 Hz, H-21), 0.85(3H, d,J=7.8 Hz, H-29), 0.81(6H, d,J=7.5 Hz, H-26, 27), 0.68(3H, s, H-18);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶37.4(t, C-1),31.4(t, C-2), 71.3(d, C-3), 42.0(t, C-4), 146.1(d, C-5), 123.7(t, C-6), 65.4(d, C-7), 37.0(d, C-8), 42.3(d, C-9), 37.5(s, C-10), 20.8(t, C-11), 39.1(t, C-12), 42.0(s, C-13), 50.0(d, C-14), 24.4(t, C-15), 28.4(t, C-16), 55.7(d, C-17), 11.7(q, C-18),18.3(d, C-19), 36.1(d, C-20), 19.1(q, C-21), 34.0(t, C-22), 29.2(t, C-23), 45.8(d, C-24), 25.5(d, C-25), 18.9(q, C-26), 19.9(q, C-27), 22.8(t, C-28), 11.9(q, C-29)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定该化合物为7α-羟基谷甾醇。

化合物7：分子式为C29H50O2，白色固体。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.21(1H, s, H-6), 3.68(1H, d,J=8.0 Hz, H-7), 3.41(1H, m, H-3), 1.03(3H, s, H-19), 0.93(3H, d,J=6.7 Hz, H-21), 0.85(3H, d,J=7.8 Hz, H-29), 0.81(6H, d,J=7.5 Hz, H-26, 27), 0.69(3H, s, H-18);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶36.9(t, C-1),31.5(t, C-2), 71.4(d, C-3), 41.7(t, C-4), 143.3(d, C-5), 125.3(t, C-6), 73.3(d, C-7), 39.4(d, C-8), 48.2(d, C-9), 36.5(s, C-10), 21.4(t, C-11), 42.8(t, C-12), 40.9(s, C-13), 56.0(d, C-14), 26.5(t, C-15), 28.4(t, C-16), 55.2(d, C-17), 12.1(q, C-18),19.2(d, C-19), 36.1(d, C-20), 19.1(q, C-21), 34.0(t, C-22), 29.1(t, C-23), 45.8(d, C-24), 25.5(d, C-25), 18.8(q, C-26), 19.9(q, C-27), 22.8(t, C-28), 12.4(q, C-29)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定该化合物为7β-羟基谷甾醇。

化合物8：分子式为C11H14O5，黄色固体粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶7.05(2H, s, H-2, 6), 4.21(2H, t,J=6.5 Hz, H-1′),1.70(2H, m, H-2′), 1.47(2H, m, H-3′), 0.97(3H, t,J=8.0 Hz, H-4′);13C-NMR(100MHz, CD3OD)δ∶121.7(s, C-1), 109.9(d, C-2, 6), 146.4(s, C-3, 5), 139.6(s, C-4), 168.6(s, C-7), 65.5(t, C-1′), 31.9(t, C-2′), 20.3(t, C-3′), 14.1(q, C-4′)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定该化合物为没食子酸正丁酯。

化合物9：分子式为C8H7O5，白色固体粉末。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ∶7.06(2H, s, H-2, 6), 3.79(3H, s, -OCH3);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ∶121.3(s, C-1), 110.0(d, C-2, 6), 146.3(s, C-3, 5), 139.6(s, C-4), 169.0(s, C-7), 52.3(q, C-8)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定该化合物为没食子酸甲酯。

化合物10：分子式为C8H8O4，黄色固体粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶7.25(1H, d,J=3.0 Hz, H-6), 6.97(1H, dd,J=8.9, 3.0 Hz, H-4), 6.78(1H, d,J=8.9 Hz, H-3);13C-NMR(100MHz, CD3OD)δ∶113.7(s, C-1), 156.4(s, C-2), 116.0(d, C-3), 124.7(d, C-4), 150.5(s, C-5), 118.7(d, C-6), 173.3(s, C-7)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定该化合物为龙胆酸。

化合物11：分子式为C5H4O3，白色粉末。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ∶10.97(1H, brs, 2-COOH), 7.65(1H, s, H-3), 7.34(1H, d,J=3.4 Hz, H-5), 6.56(1H, dd,J=3.4, 1.7 Hz, H-4);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ∶143.9(s, C-2), 120.3(d, C-3), 112.4(d, C-4), 147.6(d, C-5), 163.9(s, 2-COOH)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定该化合物为2-呋喃甲酸。

4 讨论

本研究从白族药用植物倒钩刺中分离鉴定了11个化合物，化合物1～11均为首次从该植物中分离得到，包括5个三萜：2α-羟基熊果酸(1)、乌苏酸(2)、2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid(3)、maslinic acid(4)、alphitolic acid(5)；4个酚酸：没食子酸正丁酯(8)、没食子酸甲酯(9)、龙胆酸(10)、2-呋喃甲酸(11)；2个甾体：7α-羟基谷甾醇(6)、7β-羟基谷甾醇(7)。化合物5～8、10、11为首次从悬钩子属中分离得到。

根据文献报道，上述部分化合物具有显著的生物活性。2α-羟基熊果酸(1)在125 μg/mL浓度下具有较好的体外抗人轮状病毒(HRV)作用[18]。同时，2α-羟基熊果酸(1)可以将细胞阻滞在G1期，从而发挥抗人白血病细胞HL-60作用[19]；其还可通过调节p38/MAPK信号通路，抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和诱导细胞凋亡[20]。没食子酸甲酯(9)则可通过抑制Akt和ERK1/2通路来抑制大鼠胶质瘤细胞C6和人胶质瘤细胞U373的增殖和迁移，从而发挥抗胶质瘤细胞活性[21]。此外，没食子酸甲酯(9)还具有抗炎、抗氧化和抗致龋菌等活性[22-23]。

综上所述，倒钩刺中分离鉴定的化合物的活性报道与倒钩刺的抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌等作用相一致，进一步证实倒钩刺民间用药具有一定的合理性。本研究为完善白族植物药倒钩刺的药用物质基础及进一步研究开发奠定了实验基础。