驴乳中脂肪酸的气相色谱定性与定量分析方法建立与应用

许涛，刘瑞鑫，贾瑜艳，方雷，李杨辉，周小玲*，于治成

（1塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（3新疆阿勒泰地区青河县梦圆生物科技有限公司，新疆 青河 836200）

驴乳中活性物质丰富，具有防治心血管疾病、抗疲劳、抗肿瘤的作用［1］，还具有抗菌、抑菌、提高机体免疫力、调节肠道菌群、润肤美容、辅助治疗和食疗康复等作用［2］，近年来越来越多的国内外学者参与到有关驴乳及驴乳制品的研究中［3-8］。有研究表明，驴乳平均水分含量为90%、脂肪含量为0.28%～2.00%、蛋白质含量为1.2%～2.0%、乳糖含量为5.8%～7.4%、灰分含量为 0.4%～0.5%［4］。与牛乳、羊乳、骆驼乳相比，驴乳中蛋白质、乳糖含量与人乳更为接近，具有致敏性较低、能增强免疫力等特点［2,9］。驴乳的脂肪酸组成与人乳脂肪酸组成比较接近［10］，含有丰富的人体必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）。驴乳中所含多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）n-3略高于人乳，远高于牛乳；驴乳中α-亚麻酸（α-Linolenic acid，ALA）百分比含量远高于人乳和牛乳，亚油酸（linoleic acid，LA）百分比含量和人乳较为接近，高于牛乳；驴乳中花生四烯酸（arachidonic acid，AA）百分比含量远低于人乳和牛乳，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）百分比含量高于人乳和牛乳，因此造成了驴乳较低的PUFA n-3/n-6和AA/EPA比值，适合牛奶蛋白过敏婴幼儿食用［11］。

气相色谱法因其高效的分离效能和灵敏的检测限，成为脂肪酸分析的常用技术，在乳脂肪酸分析中应用广泛。关于驴乳脂肪酸的定性定量检测近年来也有报道，如张岩春等［10］采用气相色谱法分析测定了驴乳；于静等［12］采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用分析生鲜驴乳；钱宗耀等［13］采用气相色谱-质谱联用技术测定驴乳粉。但由于饲养条件不同，乳汁营养成分不同，造成检测结果有差异，因此，有必要研究本地新疆驴驴乳样品。本试验利用岛津GC-2014C气相色谱仪，以37种脂肪酸甲酯标准品为基础，建立定性分析乳中脂肪酸、峰面积外标法和定量测定驴乳中脂肪酸含量的分析方法，并对测定结果的重现性和准确度进行评价，以期为驴乳脂肪酸检测方法提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物为塔里木大学动物科学与技术学院实训基地饲养的新疆驴，样品采自5头同一饲养标准下处于泌乳中期的母驴，手工挤奶并经四层棉质纱布过滤后，样品置于-20℃下冷冻保存备用。

脂肪酸标准品：37种脂肪酸甲酯标准品购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，详见表1。

表1 37种脂肪酸甲酯标准品及其中英文名称

续表1

试剂：正己烷（天津致远化学试剂有限公司），氢氧化钠（天津致远化学试剂有限公司），盐酸、己酸、庚酸、辛酸、甲醇均为分析纯试剂（成都西陇化学试剂玻璃仪器有限公司）。

仪器：GC-2014C气相色谱仪（日本岛津仪器有限公司），AL204电子天平（上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司），HH-S4数显恒温水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司），H2050R-1台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司），H2050R高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取乳脂

称取驴乳样品40 mL置于50 mL离心管中，以6 000 r/min离心30 min，吸出上层奶油后置于5 mL离心管中，以15 000 r/min冷冻离心30 min，在冰水中取出上层奶油。

1.2.2 乳脂皂化酯化

1）氢氧化钠-甲醇溶液（0.5 mol/L）：称取2 g氢氧化钠，用甲醇溶解并定容至100 mL，混匀。

2）盐酸-甲醇溶液（5 vt%）：取5 mL盐酸，用甲醇定容至100 mL，混匀。

3）提取的驴乳奶油在室温融化后，吸取100 μL于具塞玻璃管中，加入6 mL氢氧化钠-甲醇溶液，置于60℃下水浴15 min，再加入6 mL盐酸-甲醇溶液，在80℃下水浴60 min，冷却至室温后，最后加入5 mL蒸馏水和5 mL正己烷，振摇，静置分层后，取上清液2 mL，经0.22µm微孔滤膜过滤后，放入进样瓶中，进气相色谱仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：CP-sil88，100 m×0.25 mm×0.2 μm；检测器：FID，260 ℃；入口压力：200 kPa；色谱柱流量：N21.0 mL/min；分流比（30:1）；进样口：230℃。

程序升温：初始温度70℃，保持4 min，以13℃/min的速度上升至175℃，保持27 min，以4℃/min的速度上升至210℃，保持8 min，最后以5℃/min的速度上升至230℃，保持13 min，程序共72.83 min，可使37种脂肪酸完全分离。

1.3 脂肪酸定性、定量分析方法的建立

1.3.1 定性分析

驴乳样品中脂肪酸的保留时间与标准品中脂肪酸的保留时间进行比较，来确定各脂肪酸的峰位。

1.3.2 定量分析

以正己烷为溶剂将37种脂肪酸甲酯标准品配制成稀释液，分别为原液浓度的1/10、2/10、4/10、6/10和8/10。取1.0 μL进气相色谱仪分析，连续多次测定，采用峰面积外标法，建立线性回归方程。

1.3.3 精密度、相对标准偏差和回收率

精密度计算：在重复条件下获得两次独立的测定结果的绝对差值与算术平均值之比，以不超过算术平均值的15%为标准，标准参考GB/5009.168—2016《食品中脂肪酸的测定》［14］。

相对标准偏差（RSD）：所测样品含量的标准偏差/所测样品含量的平均值×100。

回收率计算：在测定样品时，于同一样品中加入一定量的标准物质进行测定，将测定结果扣除样品的测定值，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸的定性、定量分析

2.1.1 37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸的定性分析

37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸保留时间及定性结果如图1所示。分离度（R）是评价色谱柱总分离效能的指标，R值越大分离越完全，通常R≥1.5表示相邻两峰完全分离。若样品峰保留时间与标准品峰保留时间差小于0.1 min，则定性为同一种脂肪酸［15］。通过计算和出峰图综合分析，该标准品分离完全，此分析方式可作为一种定性分析乳中脂肪酸的较为准确的方法。

图1 37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸色谱图

2.1.2 37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸的定量分析

37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸的定量结果如表2所示，在所选浓度范围内，各脂肪酸工作曲线的相关系数r>0.997，说明在该浓度范围内峰面积与浓度线性相关性较好。RSD值介于0.29%～4.88%之间，说明该方法能有效地定量测定驴乳中各脂肪酸浓度，重复性较好；精密度介于0.37%～6.89%之间，表明此方法的精密度较高，可满足精确测量的要求。回收率在90.43%～110.78%之间；表明该方法准确度高，可有效测定驴乳中各脂肪酸浓度。总体来说，该方法所测结果重复性、精密度、准确度都可满足测试要求，可用于后续驴乳脂肪酸定量测定。

表2 37种脂肪酸甲酯标准品中脂肪酸的线性特征、RSD、精密度和回收率

续表2

2.2 驴乳样品中脂肪酸的定性、定量测定

由表3可知，从驴乳中检测出C6:0、C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C13:0、C14:0、C14:1、C15:0、C16:0、C16:1、C17:1、C18:0、C18:ln9c、C18:2n6c、C20:1、C18:3n-6共17种脂肪酸，但各样品中脂肪酸种类和含量存在较大差异。其余20种脂肪酸在本试验驴乳样本中并未检出或含量甚微。

表3中从各脂肪酸的组成来看，乳样5含量明显高于其余4个样本，推测与乳样5的母驴采食及产奶量相关。在试验过程中，个别母驴会出现喜爱吃粗饲料，对精料采食较少的情况。而驴是单胃草食动物，粗饲料中中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）所占比例较高，在驴后肠经微生物作用下转化为乙酸为主的短链脂肪酸（SCFA）［16］，乙酸是生脂前体物［17］，有利于乳脂的合成［18-19］，这样会造成乳中乳脂比例较高，产奶量相对较低的现象，从而改变乳成分含量，类似的现象在马乳［20-21］中也有报道。因此我们认为乳样5各脂肪酸含量高，与驴饲料营养因素有关。

表3 驴乳样品脂肪酸组成及含量

驴乳中以C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:ln9c、C18:2n6c这7种为主，尤其以C18:2n6c为多，平均占比为20.6%，这与张岩春等［10］、豆智华等［22］报道结果相近。从饱和脂肪酸上来看，以C10:0、C12:0、C14:0和C16:0为主，而其中C10:0～C14:0称为中链饱和脂肪酸，此类脂肪酸可直接被小肠吸收为机体供能［23］；另外月桂酸（C12:0）在体内被认为具有抗病毒和抗菌能力；肉豆蔻酸（C14:0）可以同时提高LDL-C和HDL-C的含量；棕榈酸（C16:0）能调节人体脂肪的形成［24］，并且还有抗炎、调节糖尿病患者胰岛素分泌等功能［25］。在本研究中，不饱和脂肪酸中以亚油酸（C18:2n6c）和油酸（C18:ln9c）为主，分别占15.57%和20.6%，这与豆智华等［22］的报道相近。亚油酸具有“血管清道夫”称号，可降低人体血液中胆固醇和甘油三酯等［26］，在医学和食品健康领域受到广泛重视。油酸可促进伤口愈合，且具有降血糖，调节血脂，保护心脏等作用［27］。UFA/SFA比值是反映食品中脂肪酸营养价值的重要指标，本研究测得驴乳样本中UFA/SFA比值为0.63，这与张岩春等［10］、豆智华等［22］

人报道结果不同，均小于他们所得结果，但与敖维平等［28］报道结果接近。其原因可能与饲养管理或个体差异有关，MARTINI M等［29］也曾对驴乳中UFA/SFA值个体差异较大有过报道。

3 结论

本研究运用外标法，以37种脂肪酸甲酯标准品为基础，建立了定性、定量分析驴乳中脂肪酸的分析方法。该方法具有较好的准确性和精密度，能有效地分离驴乳中各脂肪酸。采用该方法可较好地从驴乳脂肪中分离出17种脂肪酸样本，其中亚油酸（C18:2n6c）占20.6%，月桂酸（C12:0）占15.78%，油酸（C18:1n9c）占 15.57%，癸酸（C10:0）占 14.34%，棕榈酸（C16:0）占14.09%，肉豆蔻酸（C14:0）占9.64%，表明此方法适用于驴乳脂肪酸的分析。